孫海峰 楊茂偉 時永臣

摘要 目的：研究分析中藥淫羊藿苷對TDP-43介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞病變的作用機制，從而為臨床有效治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞病變提供參考依據(jù)。方法：選取并構(gòu)建TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染人軟骨細胞，并予以不同濃度的中藥淫羊藿苷進行干預(yù)。采用熒光定量PCR檢測不同組別人軟骨細胞的TDP-43基因表達情況，采用流式細胞儀檢測TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞加入中藥淫羊藿苷前后細胞凋亡情況，通過連續(xù)細胞計數(shù)觀察細胞增殖情況。分別比較3組人軟骨細胞中靶基因TDP-43與Ⅰ型膠原蛋白α1表達情況，TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞加入中藥淫羊藿苷前后細胞凋亡情況，加入不同濃度中藥淫羊藿苷培養(yǎng)后的軟骨細胞計數(shù)水平。結(jié)果：TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞中TDP-43基因表達水平為（16.02±1.45），比正常人軟骨細胞、空白慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞的（1.86±0.13）、（1.88±0.12）高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;而3組Ⅰ型膠原蛋白α1基因表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。加入不同濃度的中藥淫羊藿苷后TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞凋亡率相比加入中藥淫羊藿苷前均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。培養(yǎng)3 d后、6 d后、12 d后高濃度中藥淫羊藿苷培養(yǎng)的軟骨細胞計數(shù)比中濃度高，而中濃度中藥淫羊藿苷培養(yǎng)的軟骨細胞計數(shù)水平比低濃度高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：TDP-43可能在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞病變過程中發(fā)揮負調(diào)控作用，而中藥淫羊藿苷可通過改善上述過程，改善TDP-43介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞病變。

關(guān)鍵詞 骨關(guān)節(jié)炎;軟骨細胞病變;淫羊藿苷;TDP-43;作用機制;中藥;慢病毒轉(zhuǎn)染;細胞凋亡

Abstract Objective：To study and analyze the mechanism of icariin on TDP-43 mediated chondrocytic lesions in osteoarthritis，so as to provide a reference for effective treatment of chondrocystic lesions in osteoarthritis.Methods：TDP43 lentivirus was transfected into human chondrocytes，and intervened by icariin with different concentrations.Fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of TDP-43 gene in different groups of human chondrocytes.Flow cytometry was used to detect the apoptosis of human chondrocytes transfected with TDP43 lentivirus before and after the addition of icariin.Three sets of target genes in human cartilage cells TDP43 and collagen expression in alpha 1 Ⅰ type，the cell apoptosis of TDP43 lentivirus transfection human cartilage cells before and after adding icariin，cartilage cell count after cultivation by adding different concentration of icariin were compared respectively.Results：TDP43 gene expression level in human chondrocytes transfected with TDP43（16.02±1.45）was higher than that in normal human chondrocytes and human chondrocytes transfected with lentivirus（1.86±0.13）and（1.88±0.12），with statistically significant differences（all P<0.05）.The comparison of Ⅰ type collagen and three groups of alpha 1 gene expression levels were not obvious（P>0.05）.The apoptosis rate of human chondrocytes transfected with TDP43 lentivirus after adding different concentrations of icariin was lower than before adding icariin，with statistically significant differences（all P<0.05）.The chondrocytes cultured with high concentration of icariin after 3 d，6 d and 12 d cultivation were higher than the medium concentration，while the chondrocytes cultured with medium concentration of icariin were higher than the low concentration.And one-way analysis of variance showed that the difference between the groups was statistically significant（all P<0.05）.Conclusion：TDP-43 may play a negative regulatory role in osteoarthritis chondrocytic lesions，while icariin can improve the above process and further improve the TDP-43 mediated chondrocytic lesions in osteoarthritis.

Key Words Osteoarthritis; Chondrocyte lesions; Icariin; TDP-43; Mechanism of action; Traditional Chinese medicine; Lentivirus transfection; Apoptosis

中圖分類號：R284;R684 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.010

骨關(guān)節(jié)炎屬于臨床上較為常見的骨科疾病之一，主要是指累及軟骨以及軟骨下骨的一種退行性病變，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的破壞、軟骨下骨的吸收以及關(guān)節(jié)邊緣骨贅的形成等，對患者的生命質(zhì)量造成了嚴重影響[1]。因此，對于該病患者予以及時有效的治療顯得尤為重要。有研究報道顯示，炎性反應(yīng)是骨關(guān)節(jié)炎的重要因素之一，關(guān)節(jié)中的炎性細胞在骨關(guān)節(jié)的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)以及軟骨機械磨損等多種因素通常會促進炎性反應(yīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生，并于關(guān)節(jié)內(nèi)形成炎性環(huán)境，引發(fā)炎性疼痛。隨著炎性反應(yīng)逐漸侵襲至滑膜、軟骨下骨、韌帶等神經(jīng)末梢豐富的組織時，炎性反應(yīng)遞質(zhì)的長期存在會對神經(jīng)纖維產(chǎn)生刺激，從而導(dǎo)致病灶周圍末梢神經(jīng)發(fā)生損傷。且受損的神經(jīng)可通過促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞合成、分泌炎性反應(yīng)遞質(zhì)，從而加劇炎性反應(yīng)，形成惡性循環(huán)。隨著近年來相關(guān)研究的逐漸深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)會促進TDP-43的合成，進一步導(dǎo)致細胞凋亡。針對骨關(guān)節(jié)患者而言，如不給予及時有效的治療，隨著病情的不斷進展，會對患者的生命健康安全造成嚴重影響。然而，臨床上西醫(yī)治療效果并不十分理想，且長期使用會引發(fā)一系列不良反應(yīng)，對患者預(yù)后造成不利影響。近年來，中醫(yī)藥在臨床多種疾病的治療中展現(xiàn)了其獨有的優(yōu)勢，尤其是應(yīng)用在骨關(guān)節(jié)炎治療中，效果明顯。其中淫羊藿始載于《神農(nóng)木草經(jīng)》中，味辛甘，性溫，入肝腎二經(jīng)，具有補腎壯陽、祛風(fēng)除濕等效用，可用于陽痿遺精、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣以及筋骨瘺軟等[2]。淫羊藿苷則是淫羊藿的有效成分之一，廣泛被應(yīng)用于臨床多種骨科疾病的治療中，具有抗氧化、促進蛋白質(zhì)合成、增強機體免疫力，抑制破骨細胞活性以及促進成骨細胞生長的作用[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實，淫羊藿苷可通過促進淋巴細胞增殖、抑制淋巴細胞過度凋亡以及激活免疫細胞等途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)骨組織與骨細胞代謝的作用[4]。迄今為止，臨床上關(guān)于淫羊藿苷對TDP-43介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞病變的作用機制相關(guān)研究并不多見。我們通過研究分析中藥淫羊藿苷對TDP-43介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞病變的作用機制，旨在為臨床有效治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞病變提供參考依據(jù)。現(xiàn)報道以下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物細胞培養(yǎng) 購自美國Sciencell公司的人軟骨細胞，并采用美國Life公司生產(chǎn)的DMEM高糖培養(yǎng)基予以培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基包含100 mg/mL青霉素（購自基諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）、10%胎牛血清（購自美國Hyclone公司）以及100 mg/mL鏈霉素。待人軟骨細胞生長融合至80% ～90%后，采用0.25%的胰酶（購自基諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）予以處理，胎牛血清終止后離心除去胰酶予以擴增培養(yǎng)。本實驗研究經(jīng)倫理委員會審批（倫理審批號：20180623）

1.1.2 中藥淫羊藿苷的制備 取10 mg的淫羊藿苷粉末（購自陜西西安飛達生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：FD20110415）加入1 mL二甲亞砜（DMSO）中，混勻后繼續(xù)加入10 mL的細胞生長稀釋液，再次混勻后吸取10 μL的上述液體加入至10 mL的細胞營養(yǎng)液中，得到濃度為1 μg/mL的中藥淫羊藿苷藥液，以0.22 μm無菌濾器過濾除菌，放置于4 ℃條件下保存待用。

1.1.3 試劑與儀器 1）Trizol試劑盒（上海名勁生物科技有限公司，貨號：5003050）;2）PCR儀（購自賽默飛公司的GeneAmp 9700型）;3）二氧化碳培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司，型號：HYQX-Ⅲ）;4）臺式離心機（上海精密儀器儀表有限公司，型號：E33型）。5）PI（購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;6）流式細胞儀（購自美國貝克曼庫爾特公司，型號：DxFLEX型）;7）細胞計數(shù)儀（購自美國Invitrogen公司，型號：Countess）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）TDP-43表達載體與慢病毒包裝：采用Trizol試劑盒提取人外周血單個核細胞的總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，隨后以PCR擴增技術(shù)獲取野生型的TDP-43目的基因，引物序列如下：正義鏈：5，-GAGGATCCCCGGGTACCGGT-CGCCACCATGTCTGAATATATTCGGGTAAC-3。反義鏈：5，-TCCTTGTAGTCCATACC-CATTCCCCAGCGAGAAGACTTAG-3。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃10 min預(yù)變性，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個循環(huán)，72 ℃10 min。將上述擴增完成的片段經(jīng)由膠回收處理，以AgeI/AgeI分別雙酶切Lv-GV358-GFP。采用T4DNA連接酶促進TDP-43目的基因PCR產(chǎn)物和酶切線性的質(zhì)粒之間的連接反應(yīng)，待重組載體形成后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，通過菌液PCR檢查陽性克隆后，予以酶切鑒定處理，并移送相關(guān)公司進行測序。于6孔板上鋪293T細胞，促使其24 h匯合率達至70%，將制備獲取的三質(zhì)粒DNA溶液加入含有250 μL DMEM的培養(yǎng)基中。此外，取10 miul脂質(zhì)體Lipofectamine 2000與250 μL DMEM的培養(yǎng)基混合，放置于室溫條件下堿性5 min的孵育。隨后將上述2種溶液混合，放置于室溫條件下進行20 min的孵育，將其加入至293T細胞中，并放置于37 ℃，二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。然后更換新的培養(yǎng)液，再次放置在上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采集上清病毒液，采用熒光法測定所獲取的TDP-43-Lv-GV358病毒液的病毒滴度。2）TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染人軟骨細胞：將人軟骨細胞接種于6孔板中，每孔細胞數(shù)為3×105，體系為3 mL，首先于DMEM/高糖中培養(yǎng)過夜，隨后加入不同MOI值的慢病毒，混勻培養(yǎng)8～12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以顯微鏡明確GFP熒光強度以及最佳轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染MOI值。以最佳轉(zhuǎn)染MOI值進行慢病毒轉(zhuǎn)染，獲取轉(zhuǎn)染TDP-43慢病毒與空載體GV358慢病毒的人軟骨細胞，分別為30例與28例。見圖1。

1.2.2 干預(yù)方法 1）熒光定量PCR檢測：所有人軟骨細胞培養(yǎng)7 d后采用Trizol提取總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，包括20～50 ng的cDNA，0.2 μmol/L各引物以及10 μLGoTaq qPCR Master mix。反應(yīng)條件為95 ℃2 min，55 ℃30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)。采用Mx3005PTM Detection Systenm儀器進行檢測。其中TDP-43引物如下，正義鏈：5，-CGGCTAGCGGGAAAAGTAA-3，反義鏈：5，-GAGCCGGACACCTCTCATAC-3，;Ⅰ型膠原α1引物如下，正義鏈：5，-GGCAACCT-CAAGAAGTCCC-3，反義鏈：5，-GTGCAGCCATCCACAAGC-3。目的基因每個樣本重復(fù)檢測3次，以2-△△Ct進行表示。2）中藥淫羊藿苷干預(yù)：取TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染完成的人軟骨細胞至6孔板中，放置于DMEM/高糖中培養(yǎng)。將其隨機分成3組，分別加入不同濃度的淫羊藿苷進行干預(yù)，其中低濃度組、中濃度組、高濃度組加入淫羊藿苷濃度分別為10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL。

1.2.3 檢測指標與方法 比較3組人軟骨細胞中靶基因TDP-43與Ⅰ型膠原蛋白α1表達情況，TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞加入中藥淫羊藿苷前后細胞凋亡情況，加入不同濃度中藥淫羊藿苷培養(yǎng)后的軟骨細胞計數(shù)水平。其中細胞凋亡情況的檢測：人軟骨細胞分別在培養(yǎng)9 d后進行細胞凋亡的檢測分析：取2×105人軟骨細胞采用PBS重復(fù)洗滌2次，重懸于100 μL結(jié)合緩沖液中，加入5 μL的Annexin V-FITC與5 μL的PI，混勻后于室溫條件下染色15 min，隨后直接采用流式細胞儀進行檢測。軟骨細胞增殖分析：對軟骨細胞進行培養(yǎng)后，于顯微鏡下觀察其形態(tài)所發(fā)生的改變。并于共培養(yǎng)前后采用胰酶消化，予以臺酚藍染色，采用細胞計數(shù)儀進行檢測，每次重復(fù)檢測3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件予以數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以百分率表示，進行χ2檢驗。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，進行t檢驗。多組間的計量資料比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組人軟骨細胞中靶基因TDP-43與Ⅰ型膠原蛋白α1表達比較 TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞中TDP-43基因表達水平相比正常人軟骨細胞、空白慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;而3組Ⅰ型膠原蛋白α1基因表達水平相比均不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞加入中藥淫羊藿苷前后細胞凋亡比較 加入不同濃度的中藥淫羊藿苷后TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞凋亡率相比加入中藥淫羊藿苷前均較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 加入不同濃度中藥淫羊藿苷培養(yǎng)后的軟骨細胞計數(shù)比較 培養(yǎng)3 d后、6 d后、12 d后高濃度中藥淫羊藿苷培養(yǎng)的軟骨細胞計數(shù)水平比中濃度高，而中濃度中藥淫羊藿苷培養(yǎng)的軟骨細胞計數(shù)水平比低濃度高，3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

隨著近年來我國人口老齡化問題的日益加重，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率正呈逐年升高趨勢，已成為嚴重影響老年人膝關(guān)節(jié)以及髖關(guān)節(jié)慢性疼痛、殘廢的重要原因[5-6]。該病患者隨著病程的逐漸延長，可能會出現(xiàn)患肢關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、無法站立等臨床癥狀，病情嚴重者甚至?xí)劳觯o社會、經(jīng)濟的發(fā)展造成了極大的影響[7-8]。TDP-43是普遍存在于人體的一種核蛋白，屬于1型TAR DNA元件的結(jié)合蛋白。藥物誘導(dǎo)細胞應(yīng)急時會促使TDP-43于細胞質(zhì)中累積，參與了囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子存活與運動神經(jīng)元RNA剪接的調(diào)控過程。TDP-43在骨性關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)導(dǎo)致的細胞應(yīng)激中，可能具有一定的調(diào)節(jié)作用，促進軟骨細胞凋亡[9-10]。迄今為止，臨床上關(guān)于TDP-43在骨性關(guān)節(jié)炎中的表達是否促進軟骨細胞病變的相關(guān)報道并不多見。中醫(yī)認為，骨關(guān)節(jié)炎屬于“骨痹”“痹癥”等范疇，其主要病因為腎精虧虛，腎虛血瘀貫穿整個病理過程。因此，臨床中醫(yī)治療骨關(guān)節(jié)炎主要以補腎活血為主[11-12]。中醫(yī)學(xué)認為，腎主骨，腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，骨生髓，因此補腎之法可治關(guān)節(jié)軟骨病變以及骨質(zhì)疏松等[13-14]。淫羊藿苷對骨科疾病具有一定的調(diào)節(jié)作用，其可通過促進鈣、磷等物質(zhì)在骨中的沉積增加骨密度，同時可產(chǎn)生類似于雌激素的抗骨質(zhì)疏松作用，且有效規(guī)避了雌激素的弊端。研究報道表明，淫羊藿苷可通過不同的作用機制，對不同的基因以及細胞因子產(chǎn)生一定影響，促進成骨細胞的增殖以及分化[15-18]。目前，臨床上關(guān)于淫羊藿苷對于TDP-43基因的作用機制的相關(guān)研究較為少見。由此，我們通過研究分析中藥淫羊藿苷對TDP-43介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞病變的作用機制，目的在于明確淫羊藿苷對TDP-43介導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞病變的作用機制，為臨床治療骨關(guān)節(jié)炎提供新的靶點和思路。

本研究結(jié)果表明，TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞中TDP-43基因表達水平比正常人軟骨細胞、空白慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞高;而3組Ⅰ型膠原蛋白α1基因表達水平比較，差異不明顯。這提示了TDP-43基因轉(zhuǎn)染人軟骨細胞并不會對軟骨細胞特性產(chǎn)生較大影響。此外，加入不同濃度的中藥淫羊藿苷后TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染的人軟骨細胞凋亡率比加入中藥淫羊藿苷前低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示了TDP-43慢病毒轉(zhuǎn)染可能會增加人軟骨細胞的凋亡率。分析原因，可能與TDP-43在骨性關(guān)節(jié)炎所引起的炎性反應(yīng)以及細胞應(yīng)激過程中發(fā)揮負面的調(diào)控作用有關(guān)。其中TDP-43促進軟骨細胞凋亡的具體分子機制可能與細胞應(yīng)對不同應(yīng)激反應(yīng)，快速形成應(yīng)激顆粒有關(guān)。雖然目前體內(nèi)促使TDP-43形成應(yīng)急顆粒的具體應(yīng)急因素尚未完全明確，但在部分細胞培養(yǎng)體系中，包括熱休克、滲透應(yīng)激以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等因素均能導(dǎo)致TDP-43陽性的應(yīng)激顆粒形成。而淫羊藿苷可能是通過調(diào)控TDP-43的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制TDP-43的表達，促進了骨細胞的增殖以和分化，并可在骨組織中發(fā)揮作用，促進骨形成以及成骨細胞的生長，最終達到降低人軟骨細胞凋亡率的目的[19-20]。而隨著淫羊藿苷濃度的增加，其藥效也隨之增強，因此其抑制軟骨細胞凋亡的作用也更加明顯。另外，培養(yǎng)3 d后、6 d后、12 d后高濃度中藥淫羊藿苷培養(yǎng)的軟骨細胞計數(shù)水平比中濃度高，而中濃度中藥淫羊藿苷培養(yǎng)的軟骨細胞計數(shù)水平比低濃度高，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示了淫羊藿苷有利于提高軟骨細胞計數(shù)，且存在劑量依賴效應(yīng)。究其原因，可認為淫羊藿苷是通過激活P38以及ERK1/2通路，從而促使細胞G1期阻滯，P38通路的激活可對細胞周期的阻滯產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，而ERK1/2通路不僅在細胞周期中發(fā)揮著正調(diào)節(jié)作用，同時可誘導(dǎo)G1期阻滯起調(diào)節(jié)作用[21-23]。因此，淫羊藿苷有利于關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖，且隨著其濃度的增加，效果更加明顯。

綜上所述，中藥淫羊藿苷可能通過改善TDP-43在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞病變過程中的負調(diào)控作用，從而有利于調(diào)節(jié)軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞病變的恢復(fù)。

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（2018-08-17收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）