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        石斛屬植物質量評價技術的研究進展

        2019-09-10 05:36:18孫晶劉佳妮孫玉鳳劉佳萌賈寧王東暉王慧王珊珊葉煒顏沛沛范蓓戴小楓
        中國食物與營養(yǎng) 2019年9期

        孫晶 劉佳妮 孫玉鳳 劉佳萌 賈寧 王東暉 王慧 王珊珊 葉煒 顏沛沛 范蓓 戴小楓

        摘 要:綜述了近年來我國石斛屬植物的質量評價技術研究進展,目前主要集中在紫外分光光度法測定多糖的含量;高效液相色譜法測定氨基酸、毛蘭素等酚類以及單糖類成分的含量,并建立指紋圖譜;液質聯用色譜法和氣質聯用色譜法主要用于分析石斛中的化學成分??傮w上,在眾多石斛屬植物中,文獻中報道的對鐵皮石斛的研究最多,而其他石斛屬植物研究較少;質量標準有待進一步完善。

        關鍵詞:石斛屬;質量評價;質量標準;酚類

        石斛屬為蘭科第二大屬,包括約1 500余種植物[1],我國有74個種、2個變種,大多分布在云南、貴州、廣東、廣西等地[2]。石斛的花觀賞價值較高,而石斛的莖一直被藥用。石斛始載于《神農本草經》[3],主要成分為多糖、生物堿、聯芐、黃酮、木脂素等成分[3-6],現代藥理學研究表明,石斛具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、促消化等活性[7-8]?!吨袊幍洹?015年版[9]中收錄的品種僅有4種,包括金釵石斛(D.nobilie Lindl.)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum Lindl.)、流蘇石斛(D.fimbriatum Hook.)、鐵皮石斛(D.officinale Kimura et Migo)。中國的石斛種類很多,大多成分還未有明確的質量控制方法,造成石斛在市場上品種混雜,偽品、混淆品較多。本文對石斛屬植物中的主要成分的質量評價技術進行綜述,為石斛的進一步研究和開發(fā)提供科學依據。

        1 紫外分光光度法

        1.1 多糖類

        《中國藥典》2015年版規(guī)定[9],用無水葡萄糖為對照品,苯酚-硫酸法在488 nm處測定吸光度,以此測定鐵皮石斛中多糖的含量。甘小娜等[10]用該方法測定的紫皮石斛中多糖的含量約為35.7%~52.1%。謝魯靈楓等[11]用該方法測定了12個不同批次鐵皮石斛中多糖的含量,約為0.01~0.06 mg/g。張桂玲等[12]用該方法測定了不同產地鐵皮石斛與楓斗的多糖含量,結果表明,浙江鐵皮楓斗中多糖含量最高,達32.82%。李龍囡等[13]用該方法測定了不同產地鐵皮石斛中多糖的含量,約為22.5%~63.49%。李貝貝等[14]建立了鐵皮石斛多糖閃式提取的工藝,并用苯酚-硫酸法對24 批不同產地、不同品種石斛的多糖含量及單糖組成進行聚類分析,擬定了鐵皮石斛多糖質量標準。

        1.2 生物堿類

        金蓉鸞等[15]以石斛堿為對照品,用分光光度法測定石斛堿濃度與溴甲酚綠吸收度的關系,以此測定石斛中總生物堿含量。王再花[16]等用該方法測定了26種野生種和9個春石斛品種的生物堿的含量,約在0%~0.638%之間。

        1.3 黃酮類

        謝魯靈楓等[11]用紫外分光光度法測定了12個不同批次鐵皮石斛中總黃酮的含量,約為0.69~4.48 mg/g。

        1.4 花色苷類

        楊曉娜等[17]用溶劑法提取出龍陵鐵皮石斛的花色苷,用紫外分光光度計在200~750 nm處掃描,發(fā)現分別在268.3、530.0 nm處有吸收峰。

        2 高效液相色譜法

        2.1 含量測定方法

        2.1.1 單糖類 《中國藥典》2015年版規(guī)定[9],以鹽酸氨基葡萄糖為內標,用高效液相色譜(HPLC)法測定鐵皮石斛中甘露糖的含量,應為13.0%~38.0%。甘小娜等[10]用該方法測定了紫皮石斛中甘露糖的含量,約為27.8%~46.1%。梁盛等[18]以L-巖藻糖為內標,用HPLC法測定了6種石斛中水溶性多糖和堿溶性多糖中5種單糖(D-甘露糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D木糖的含量),結果表明,石斛的堿溶性多糖的質量分數較高,且水溶性多糖和堿溶性多糖的單糖組成成分與各單糖質量分數不同。李龍囡等[13]用HPLC法測定了不同產地鐵皮石斛中甘露糖的含量,約為14.1%~39.2%。羅在柒等[19]用HPLC法檢測了不同種植方式鐵皮石斛總多糖中的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖的含量,結果表明,巖石種植方式甘露糖含量較高,相對品質較好。陳丹青等[20]以鮮鐵皮石斛為原料,比對高溫烘烤卷曲制得鐵皮楓斗、常壓低溫(45℃)鼓風烘干制得鐵皮石斛片、真空冷凍干燥制得鐵皮石斛粉3種不同加工品中甘露糖的含量,結果表明,低溫鼓風干燥所得的鐵皮石斛片甘露糖含量較高。

        2.1.2 酚類 《中國藥典》2015年版規(guī)定[9],用HPLC法測定鼓槌石斛中毛蘭素的含量,不得少于0.030%。謝魯靈楓等[11]用HPLC法測定了12個不同批次鐵皮石斛中石斛酚的含量,約為0.01~0.06 mg/g。葉子等[21]用HPLC法建立了鐵皮石斛中柚皮素的含量測定方法,20批鐵皮石斛中柚皮素的含量約為0.190~0.498 mg/g。謝魯靈楓等[11]用HPLC法測定了12個不同批次鐵皮石斛中柚皮素的含量,約為0.009 2~0.124 8 mg/g。劉剛等[22]用HPLC法同時測定了不同年限霍山石斛中丁香酸、蘆丁、石斛酚、柚皮素等4個成分的含量。李巖等[23]將不同產地的鐵皮石斛用甲醇超聲萃取,經固相萃取柱凈化后,用HPLC檢測其中的化學成分。通過與13種酚酸類化合物對照品的比對,共檢出12種酚酸,其中阿魏酸含量最高,其次是丁香酸等。

        2.1.3 氨基酸類 紀照紅等[24]將石斛進行酸水解,再用N,N-2,4-二硝基氟苯進行衍生化處理,再用HPLC分析新疆不同年限鐵皮石斛中的氨基酸類成分,結果表明,必需氨基酸總量、非必需氨基酸總量和鮮味氨基酸總量均隨著生長年限的增加不斷增長,三年生鐵皮石斛藥效氨基酸含量較高。

        2.2 指紋圖譜方法

        謝魯靈楓等[11]用HPLC法建立了12個批次鐵皮石斛的指紋圖譜,發(fā)現了38個共有峰,鑒定了柚皮素和石斛酚2個色譜峰。劉剛等[22]用HPLC法建立了39個不同來源、不同年限霍山石斛的指紋圖譜,指認了丁香酸、蘆丁、石斛酚、柚皮素等4個共有峰。劉紅梅等[25]建立了黑毛組與頂葉組的13種石斛的指紋圖譜,結果表明,黑毛組石斛有5個共有峰,頂葉組石斛有17個共有峰,兩組石斛的化學成分具有明顯的差異,可作為石斛的鑒別方法。李杰等[26]收集了29份不同栽培產地的鐵皮石斛,用HPLC法建立了指紋圖譜,找到了13個共有峰。

        3 液質聯用色譜法

        夏杰等[27]用UPLC-Q-TOF法對金釵石斛乙酸乙酯萃取部位進行了化學成分分析,共鑒定了45個化合物,包括生物堿類、聯芐類、菲類、倍半萜類等。Ye等[28]用HPLC-ESI-MS方法鑒定了鐵皮石斛和齒瓣石斛中的26種化學成分,大多為黃酮苷、木脂素和小分子酚類等成分。Zhou等[29]用UHPLC-LCQ-ion trap-MS總結了黃酮苷類成分的質譜裂解規(guī)律,從紫皮石斛中檢測到15個色譜峰,并鑒定了其中13種成分為黃酮苷類成分。Wang等[30]用UPLC-QToF-MS總結了石斛堿型和諾貝堿型的生物堿的質譜裂解規(guī)律,并通過比較各品種的圖譜,發(fā)現這兩類生物堿是金釵石斛的專屬特征性成分。Cai等[31]用UPLC-QToF-MS鑒定了鼓槌石斛中的29個苯丙烷類成分和24個茋類成分,其中14個可能是新化合物。魯艷柳等[32]將石斛堿灌胃給藥小鼠(60 mg/kg),用超高效液相色譜-質譜/一測多評法(UPLC-MS/QAMS)測定了石斛堿及其代謝產物M-250和M-280的血藥濃度,分別為41.3、493.0、41.4 ng/mL。Ma等[33]用機械化學法提取出鐵皮石斛中的多糖,并進一步將多糖酸水解成寡糖,用UPLC-MS2的方法鑒定了各個寡糖的結構。周桂芬等[34]用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)柱前衍生化-HPLC-DAD-ESI-MSn對鐵皮石斛莖、葉中多糖的組成進行了研究,結果表明,鐵皮石斛葉多糖是一種酸性雜多糖,主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖組成,而鐵皮石斛莖多糖主要由葡萄糖和甘露糖組成,且莖中甘露糖和葡萄糖含量均比葉中高。Wu等[35]用超高效液相色譜法建立了不同來源霍山石斛的指紋圖譜,并用LCQ-FLEET離子阱質譜儀總結了黃酮苷類成分的質譜裂解規(guī)律,鑒定了其中的8個色譜峰。徐德林等[36]用LC-MS法測定了不同產地金釵石斛和鐵皮石斛中石斛堿的含量,結果表明,金釵石斛干莖中石斛堿的含量均高于6 mg/g,而鐵皮石斛僅為0.93~2.76 mg/g,進一步分析發(fā)現,鐵皮石斛中石斛堿的含量高低主要受環(huán)境影響,金釵石斛中石斛堿的含量主要受基因型影響。Yang等[37]用液質聯用技術,鑒定了線葉石斛中的9個酚類成分,并用HPLC-DAD同時測定了其中4個成分(香豆素、石斛酚、大葉蘭酚、拖鞋狀石斛素)的含量。Zhang等[38]用HPLC-DAD-EAI-MS方法拆分了球花石斛中的3對對映異構體(東莨菪內酯、東莨菪堿和阿雅平),并在342 nm下建立了同時測定其中的7個成分的含量測定方法。

        4 薄層色譜法

        《中國藥典》2015年版規(guī)定[9],金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛提取物中應用薄層色譜法分別檢測到石斛堿、毛蘭素、石斛酚的斑點。葉子等[21]從鐵皮石斛中分離鑒定了一個黃酮碳苷類成分佛來心苷,并建立了鐵皮石斛中佛來心苷、夏佛塔苷的薄層色譜(TLC)鑒別法。通過比較不同品種石斛的薄層色譜圖,發(fā)現佛來心苷為鐵皮石斛的專屬性成分,可用于該品種的質量控制。劉紅梅等[25]采用TLC法分析黑毛組與頂葉組石斛化學成分的差異,結果表明,該方法可以鑒別小黃花石斛、鼓槌石斛和球花石斛。張俊儀等[39]分別以石斛堿、石斛酚、柚皮素為對照品,建立了美花石斛中生物堿、聯芐類、黃酮類成分的TLC鑒別方法,用以區(qū)分美花石斛與霍山石斛等其他品種。劉霞等[40]對益胃消瘀顆粒進行質量標準研究,其中用TLC法鑒別了黃花石斛中的石斛酚。

        5 離子色譜法

        張桂玲等[12]以鈉型陽離子交換樹脂為填料,用離子交換色譜法測定不同產地鐵皮石斛和楓斗中氨基酸的含量,結果表明,貴州葉片中各類氨基酸含量最高。陳懿瑤等[41]用陰離子交換色譜-脈沖安培(HPAEC-PAD)方法,檢測了20種石斛中7種單糖(甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、果糖、乳糖)的含量,并通過主成分分析和聚類分析,發(fā)現了不同品種石斛中單糖組分的差異。李龍囡等[13]將不同產地鐵皮石斛提取液經Na+型磺酸基強酸性陽離子交換樹脂色譜柱,再用氨基酸分析儀測定18種氨基酸的含量,結果表明,鐵皮石斛中含有豐富的人體必需氨基酸,平均含量為8.76 mg/g。

        6 氣質聯用色譜法

        《中國藥典》2015年版規(guī)定[9],以萘為內標,用氣相色譜法測定金釵石斛中石斛堿的含量,不得少于0.4%。曲繼旭等[42]用氣質聯用色譜(GC-MS)法,分別從金釵、鐵皮、紫皮、鼓槌石斛中鑒定出21、26、37、31種揮發(fā)性成分。Chen等[43]用頂空氣相色譜-質譜聯用技術,檢測到野生和栽培的霍山石斛、鐵皮石斛、細莖石斛提取物中63種揮發(fā)性成分,并鑒定了其中的53個化合物,包括環(huán)己烯、糠醛等。Jin等[44]用GC-MS法分析了不同年限生長的鐵皮石斛和霍山石斛的化學成分,并用代謝組學的方法對其進行了研究,結果表明,對鐵皮石斛和霍山石斛分類貢獻較大的為蔗糖、葡萄糖、半乳糖等11種成分,從代謝產物積累方面來看,采收期以第三年為最佳。張聰等[45]用GC-MS法對細莖石斛花的正己烷提取物中的揮發(fā)性成分進行了分析,共檢測到97個色譜峰,鑒定了其中的72個化合物,包括二十一烷、二十二烷、二十三烷等。顏壽等[46]以萘為內標,用氣相色譜法測定合江金釵石斛在不同采收期時石斛堿含量的變化,結果表明,石斛堿的含量約為0.22%~0.48%,且一年生>二年生>三年生。Jiao等[47]用GC-MS結合LC-MS研究了鐵皮石斛的代謝產物,共鑒定了78個代謝產物,并進一步用多元統計方法比較了色氨酸、次番木鱉甙、茉莉酸甲酯處理組與對照組代謝物的差異,鑒定出29個差異代謝物。

        7 原子分光光度法

        張桂玲等[12]用原子分光光度計測定不同產地鐵皮石斛和楓斗中鉀、鈣、鎂等必需元素的含量,結果表明,鉀、銅含量均以安徽鐵皮楓斗最高;鈣、鋅含量均以黔產鐵皮石斛葉片最高。王佳芷等[48]將鐵皮石斛高壓消解后,采用石墨爐原子吸收法測定鉛、鎘、鉻的含量,采用火焰法測定酮的含量。嚴華等[49]采用微波消解電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)技術測定各地鐵皮石斛中鉛、鎘、砷、汞、銅5 種重金屬及有害元素的含量,結果表明,鉛含量為0.28~2.3 mg/kg、Cd 含量為0.07~2.24 mg/kg、砷含量為0.030~1.020 mg/kg、汞含量為0.002~0.141 mg/kg、銅含量為1.125~3.456 mg/kg。楊曉娜等[50]采用乙炔-空氣火焰原子吸收法測定了4個品種石斛中鉻、銅、鎂、錳、鎳、鋅6 種微量元素含量,結果表明,兜唇石斛鎂含量較高,鐵皮石斛鎳、可溶性糖含量較高,紫皮石斛鉻、銅含量較高,紫菀石斛錳、鋅含量較高。

        8 紅外光譜結合化學計量學法

        曾貞等[51]采集了不同采收時間鐵皮石斛的紅外光譜信息,歸屬紅外光譜吸收峰,并結合一階導數、二階導數、偏最小二乘回歸模型等化學計量學方法,預測樣品中總多糖含量,結果表明,預測值與測量值較接近,可用石斛中總多糖含量的快速預測。孫恒等[52]用該方法預測了1年中不同采收期鐵皮石斛中總黃酮的含量,結果表明,總黃酮含量隨時間的累積先上升后降低,最高值與鐵皮石斛開花結籽時間相吻合,與多糖含量變化趨勢相反。

        9 其他方法

        闕彩霞等[53]將不同階段鐵皮石斛莖段和葉片制作半薄切片,用PAS染色法對樣品進行染色處理,以此研究石斛多糖的分布,結果表明,多糖主要存在于細胞壁和液泡中,即石斛多糖主要儲存在于莖段中。張靜芳等[54]收集了30個不同來源的鐵皮石斛,測定了假鱗莖長度等14個指標,利用主成分分析、聚類分析等分析方法對鐵皮石斛品質評價指標進行研究,結果表明,假鱗莖長度、假鱗莖姿態(tài)、假鱗莖顏色、醇溶性浸出物含量和多糖含量更能代表鐵皮石斛的品質。陳傳平等[55]用毛細管電泳法分析霍山石斛多酚提取液,用加沉淀試劑前后色譜峰的變化判定多酚成分,并進一步比較了不同光照處理對霍山石斛多酚含量積累的影響,結果表明,紅藍光照處理根、莖和葉各部分多酚含量比模擬自然光照處理的少,但多酚種類則是紅藍光照處理的較多。李龍囡等[13]用ICP-MS法測定了不同產地鐵皮石斛中微量元素的含量。

        10 討論

        由于石斛種類繁多,各品種的化學成分和功效各不相同,而《中國藥典》2015年版中僅收錄了金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛和鐵皮石斛的質量評價方法。建議增加其他常用品種石斛如紫皮石斛、銅皮石斛等的質量標準,對于市場流通有嚴格的把控。建議不斷研究和改進石斛的國家或行業(yè)標準,增加石斛中多種成分的含量的測定方法,同時控制石斛的質量,促進石斛產業(yè)健康、持續(xù)性發(fā)展。

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        Abstract:Research progress of the methods and techniques on quality evaluation of the genus Dendrobium plants were reviewed.Ultraviolet spectrophotometry was used to determine the content of polysaccharide.HPLC method was adopted to establish the fingerprint and determine the content of amino acids,phenolic compounds (eg Erianin)and monosaccharides.LC-MS and GC-MS were powerful analytical techniques for the detection and determination of chemical constituents in the genus Dendrobium.Above all,among series species of Dendrobium genus,D.officinale Kimura et Migo has been studied most,and the quality standard need to be improved.

        Keywords:Dendrobium;quality evaluation;quality standard;phenolic compound

        (責任編輯 唐建敏)

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