曹 艷，徐亞潔，運(yùn)乃茹

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250)

腎病綜合征主要是由腎小球病變所致的一組臨床證候群，其典型表現(xiàn)為各種代謝紊亂，如大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥。雷公藤多苷是從衛(wèi)矛科植物雷公藤的去皮根中提取精制的有效部位混合物，對(duì)腎病綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等難治性或頑固性疾病療效獨(dú)特，有“中草藥激素”之稱[1]。其見效快、療效確切，幾乎沒有可以完全替代的中藥，但自雷公藤多苷投入臨床以來(lái)，不良反應(yīng)事件頻繁報(bào)道[2,3]。分析原因，一方面是缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量控制方法，另一方面雷公藤多苷的部分有效成分也有一定的毒性。因此，本文在建立雷公藤多苷片HPLC指紋圖譜的基礎(chǔ)上，結(jié)合體外改善代謝紊亂的藥理實(shí)驗(yàn)研究，采用偏最小二乘法(partial least-squares regression，PLS)分析二者的相關(guān)性，為全面評(píng)價(jià)雷公藤多苷的質(zhì)量提供依據(jù)，也為雷公藤多苷深層次的藥效-毒性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1藥品與試劑 雷公藤多苷片購(gòu)自市售藥店，批號(hào)及生產(chǎn)廠家見表1；雷公藤甲素、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素(批號(hào)依次為140424、130925、130823、130420、130925、130325)對(duì)照品均購(gòu)自成都思天德生物科技有限公司；注射用鹽酸阿霉素(批號(hào)H33021979)購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；蛋白定量測(cè)試盒、總膽固醇測(cè)試盒、甘油三酯測(cè)試盒、白蛋白測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；乙腈為色譜純，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司生產(chǎn)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 雷公藤多苷片生產(chǎn)廠家及批號(hào)

1.2儀器與設(shè)備 Agilent1200高效液相色譜儀；KQ-400KDE數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Mettler Toledo XS205DV電子天平(瑞士Mettler Toledo)；3K15型冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠80只，雄性，體重(200±20) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，使用許可證號(hào)SYXK(津)2014-0002，飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飲用水經(jīng)自動(dòng)制水機(jī)制得。

2 方法與結(jié)果

2.1雷公藤多苷片的HPLC指紋圖譜 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，將雷公藤多苷片超聲提取后，過(guò)中性氧化鋁柱進(jìn)行純化，制備供試品溶液。采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm，柱溫為35 ℃，流速為0.75 ml/min，以水(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(0～15 min，10%→35% B；15～22 min，35% B；22～30 min，35%→55% B；30～35 min，55% B；35～40 min，55%→60% B；40～70 min，60%→85% B；70～75 min，85%→95% B；75～80 min，95%→10% B)，建立了6批雷公藤多苷片的HPLC指紋圖譜，運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件處理，生成對(duì)照指紋圖譜，確定了22個(gè)共有特征峰，見圖1。對(duì)指紋圖譜的特征峰進(jìn)行指認(rèn)，確定10、12、22號(hào)峰分別為雷公藤晉堿、雷公藤次堿和雷公藤內(nèi)酯甲。

圖1 6批雷公藤多苷片的HPLC指紋圖譜疊加圖

2.2雷公藤多苷片改善腎病綜合征大鼠代謝紊亂的研究 SD大鼠隨機(jī)分為8組，分別為正常組、模型組和給藥組1～6，每組10只，于實(shí)驗(yàn)開始后第4日，模型組和給藥組尾靜脈一次性注射鹽酸阿霉素6.5 mg/kg建立動(dòng)物模型；于第12日給藥組1～6分別灌胃生產(chǎn)廠家為A～F的雷公藤多苷片，劑量為30 mg/kg，正常組及模型組灌胃等體積的生理鹽水，1次/d[5]。各組大鼠于灌胃4周末，用代謝籠收集24 h尿液，并于收集尿液結(jié)束當(dāng)天，全部大鼠乙醚吸入麻醉，心臟穿刺采血，室溫下2 h內(nèi)離心，取血清，-20 ℃冰箱保存待測(cè)[5]。采用試劑盒測(cè)定各項(xiàng)血、尿生化指標(biāo)，包括24 h尿蛋白、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血清白蛋白(Alb)，結(jié)果見表2。

表2 雷公藤多苷片對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)的影響

與模型組比較，*P<0.05

2.3譜效關(guān)系研究 以標(biāo)準(zhǔn)化處理的指紋圖譜中各共有峰峰面積為X，各項(xiàng)生化指標(biāo)值為Y，采用偏最小二乘法進(jìn)行相關(guān)分析，擬合出指紋圖譜中各共有峰峰面積與各項(xiàng)生化指標(biāo)值之間的回歸方程，其中回歸系數(shù)反映了各X對(duì)Y的貢獻(xiàn)大小，PLS回歸系數(shù)的絕對(duì)值越大，說(shuō)明該共有色譜峰對(duì)改善該指標(biāo)的貢獻(xiàn)就越大。各X對(duì)應(yīng)Y的回歸系數(shù)見表3。

由表3可知，共有峰對(duì)24 h尿蛋白的貢獻(xiàn)率大小依次為:X9>X20>X1>X7>X3>X6>X11>X14>X15>X16>X10>X19>X8>X17>X13>X21>X2>X5>X22>X18>X4>X12，指紋圖譜中1、2、4、6、11、14、15、17、19、20、21和22號(hào)峰與24 h尿蛋白水平呈負(fù)相關(guān)；共有峰對(duì)血清白蛋白的貢獻(xiàn)率大小依次為:X9>X10>X7>X3>X8>X13>X20>X16>X14>X1>X5>X15>X11>X6>X19>X4>X17>X21>X2>X22>X18>X12，指紋圖譜中6、11、14、15、17、18、19、20、21和22號(hào)峰與血清白蛋白水平呈正相關(guān)；共有峰對(duì)總膽固醇的貢獻(xiàn)率大小依次為:X9>X10>X14>X6>X20>X7>X1>X19>X15>X17>X11>X21>X13>X3>X22>X2>X4>X8>X16>X5>X18>X12，指紋圖譜中1、2、4、5、6、11、14、15、17、18、19、20、21和22號(hào)峰與總膽固醇水平呈負(fù)相關(guān)；共有峰對(duì)甘油三酯的貢獻(xiàn)率大小依次為:X1>X14>X13>X16>X6>X10>X5>X4>X9>X11>X8>X3>X18>X15>X2>X20>X19>X22>X7>X21>X17>X12，指紋圖譜中1、2、3、4、5、6、8、14、17、19、20和22號(hào)峰與甘油三酯水平呈負(fù)相關(guān)。綜合來(lái)看，推測(cè)6、14、17、19、20、22號(hào)峰是減少24 h尿蛋白、改善低蛋白血癥和高脂血癥的主要色譜峰；另外，1、2和4號(hào)峰對(duì)應(yīng)的極性較大的物質(zhì)，對(duì)24 h尿蛋白的減少和高脂血癥的改善也有一定促進(jìn)作用。

表3 雷公藤多苷片共有峰的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)

3 討論

雷公藤多苷片在《中國(guó)藥典》(2015版)中未收錄，在《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》(第十七冊(cè))中有收錄，其含量測(cè)定是采用薄層掃描法測(cè)定雷公藤內(nèi)酯甲的含量。本研究的HPLC指紋圖譜中，22號(hào)峰為雷公藤內(nèi)酯甲，6批雷公藤多苷片的22號(hào)峰峰面積大小依次為：B>D>C>A>E>F，若以雷公藤內(nèi)酯甲作為質(zhì)控指標(biāo)，6個(gè)生產(chǎn)廠家的雷公藤多苷片的質(zhì)量依次為：B>D>C>A>E>F。

中藥譜效關(guān)系研究中的數(shù)據(jù)分析方法有灰色關(guān)聯(lián)度分析、雙變量相關(guān)分析、多元線性回歸、偏最小二乘回歸、典型相關(guān)分析等。偏最小二乘回歸分析綜合了多元回歸分析、典型相關(guān)分析和主成分分析，且對(duì)于自變量間存在多重相關(guān)性以及樣本數(shù)量少于自變量數(shù)量時(shí)尤為適用[6,7]。本研究采用偏最小二乘法對(duì)指紋圖譜共有峰峰面積和24 h尿蛋白、總膽固醇、甘油三酯、血清白蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明6、14、17、19、20和22號(hào)色譜峰可能是雷公藤多苷片中減少24 h尿蛋白、改善高脂血癥和低蛋白血癥的主要色譜峰，由于僅指認(rèn)出改善代謝紊亂的色譜峰，而其具體成分均未進(jìn)行定性和定量研究，因此雷公藤多苷片改善代謝紊亂的譜效關(guān)系還有待進(jìn)一步的深入研究和完善。