楊煥治 熊芳琪 楊嵐 楊中揚(yáng) 陳咸吉 聶現(xiàn)輝 彭國平

摘 要：目的：探究不同組分羧甲基茯苓多糖（CMP）對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。方法：在不同提取堿濃度和堿處理時(shí)間下，采用二次加堿法制備不同組分CMP。利用硫酸-蒽酮法、滴定法和CCK-8法對(duì)CMP的含量、取代度和HepG2細(xì)胞增殖檢測(cè)。結(jié)果：獲得7個(gè)組分CMP，含量為85%～90 %，取代度為0.65～0.80。不同濃度CMP培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24 h下，CMP 750 μg/mL抑制細(xì)胞增殖效果最好，其中CMP3抑制率最高達(dá)50.035 %。CMP 750 μg/mL培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24、48、72 h，在48 h下抑制效果最好，其中CMP3抑制效果最高達(dá)到76.05 %。在72、48、24 h 下CMP3培養(yǎng)HepG2細(xì)胞的IC50分別為26.34、34.06、763.64 μg/mL。結(jié)論：CMP能有效抑制HepG2腫瘤細(xì)胞的增殖，其中CMP3是7個(gè)CMP組分中抑制效果最好的，這與CMP3的含量、濃度呈正相關(guān)性，48 h為CMP最適抑制時(shí)間。

關(guān)鍵詞：不同組分;羧甲基茯苓多糖;HepG2;細(xì)胞增殖

茯苓多糖羧甲基化可增加茯苓多糖支鏈的負(fù)電性、水溶性，改善生物功能，提高抗癌活性[1-2]。HepG2是人肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系，其保留了較完整的代謝酶，是良好的肝癌發(fā)生機(jī)制研究材料[3]。CCK-8法是抗腫瘤藥物篩選、腫瘤藥敏、細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性試驗(yàn)的理想方法，其操作簡便、靈敏度高、可重復(fù)性高[4]。目前，大量研究證實(shí)，天然提取物能作用于細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中一些重要凋亡因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增殖[5]。迄今全球肝癌的發(fā)病率及病死率高居不下，同時(shí)肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并未明確[6]。本實(shí)驗(yàn)探究不同CMP組分對(duì)HepG2細(xì)胞增殖影響，為CMP抑制HepG2細(xì)胞增殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白茯苓塊，湖南省靖州產(chǎn);HepG2人肝癌細(xì)胞系，采購中科院上海細(xì)胞庫;無水乙醇（CHO）、氫氧化鈉（NaOH）、氯乙酸（ClCH2COOH）、乙醚（C4H10O）、冰醋酸（CH COOH）、丙酮（CH3COCH3）、FeCl3、鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、三氯乙酸（CH2Cl3O2）都為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;RPMI-1640、PBS緩沖液、小牛血清，Hyclone公司;胰蛋白酶消化液、胎牛血清、鏈霉素、青霉素，GIBCO公司;二甲基亞砜（DMSO）、Tris-Base（SIGMA）、10 %SDS，美國Sigma公司;CCK-8試劑盒，南京凱基生物公司。

FW177型中草藥粉碎機(jī)、FA/JA系列電子天平、DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵、DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋、PHS-3C pH計(jì)、Agilent 8453紫外-可見分光光度計(jì)、KQ-3200E超聲波清洗器、冷凍高速離心機(jī)、細(xì)胞恒溫箱、光學(xué)顯微鏡、ST-360酶標(biāo)儀、血球計(jì)數(shù)板、超凈工作臺(tái)。

1.2 方法

1.2.1 CMP的制備 依據(jù)參考文獻(xiàn)[7]制備CMP：將茯苓菌塊烘干至恒重，然后粉碎過60目篩網(wǎng)。精密稱量茯苓粉10 g置于500 mL燒杯中，再加入200 mL蒸餾水，置于超聲提取儀中提取30 min，然后浸提過夜，浸提液過濾得濾渣。用5倍不同濃度的NaOH堿溶液（0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L）溶解濾渣。溶解液置于4℃下，浸提不同時(shí)間（2、4、6、8 h），抽濾后向堿浸提液中加入氯乙酸和NaOH溶液，70 ℃醚化反應(yīng)3 h，用乙酸中和至pH為5，醇沉過夜，沉淀抽濾后用無水乙醇、丙酮、無水乙醚進(jìn)行洗脫，復(fù)溶，DEAE-52離子交換柱洗脫，透析，冷凍干燥，得CMP粉。

1.2.2 CMP含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8]，利用硫酸-蒽酮法測(cè)定CMP含量：準(zhǔn)確稱取恒重標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20.0 mg，置于三角瓶溶解，容量瓶定容至200.0 mL。分別吸取該溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，并各補(bǔ)蒸餾水至1.0 mL，冰浴5 min后，滴加蒽酮-濃硫酸4.0 mL，沸水浴10 min顯色。以0 mL管為參比，用紫外分光光度計(jì)在620 nm 波長處測(cè)定吸光值。用Excel數(shù)據(jù)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 CMP取代度測(cè)定 滴定法[9]測(cè)定CMP的取代度。準(zhǔn)確稱取0.5 g干燥的CMP于三角瓶中，加入HCl（0.1 mol/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL，NaOH（0.1 mol/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液為滴定液，滴定過程中檢測(cè)滴定溶液pH值。

DS=0.203A/（1-0.058A） A=（V2-V1）M/W（1）

式（1）中，DS：取代度;A：羧甲基的物質(zhì)的量（mmol）;V1：pH=2時(shí)滴定消耗NaOH 體積（mL）;V2 ：pH=4 時(shí)消耗NaOH體積（mL）;W：CMP重量（g）;M：NaOH濃度（mol/L）。

1.2.4 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株HepG2常規(guī)培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱（5 % CO2）培養(yǎng)，每3 d換液1次。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)CMP對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用HepG2細(xì)胞（1×104/ mL）接種于96孔板/100 μL，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱（5 % CO2）培養(yǎng)24 h。棄除原有培養(yǎng)液，分別加入空白對(duì)照組（完全培養(yǎng)液），CMP組完全培養(yǎng)液（5、50、100、300、750 μg/mL）每組6個(gè)平行孔。96孔板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～72 h，棄除舊培養(yǎng)液，再加入100 μL培養(yǎng)液，CCK-8檢測(cè)液（10 μL）滴加到96孔板，37℃下孵育2.5 h。二甲基亞砜（100 μL）溶解結(jié)晶，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測(cè)各孔OD值，計(jì)算HpeG2細(xì)胞生長抑制率。

細(xì)胞抑制率（%）= （對(duì)照細(xì)胞OD值-加藥細(xì)胞OD值）/對(duì)照組OD值×100%（2）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)4次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。采用SPSS 22.0分析組間差異性。P<0.05、P<0.01分別表示組間具有顯著性差異、極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMP制備的組分、含量及取代度的測(cè)定

由圖1可知，葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線是y=0.092 43x+0.030 9，R2=0.999線性關(guān)系很好。以相同濃度的CMP，進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)取數(shù)值平均值，測(cè)定CMP含量。由表1可知，采用二次加堿法，在不同提取堿濃度和堿處理時(shí)間下一共制備了7個(gè)不同組分的CMP。通過硫酸-蒽酮法檢測(cè)CMP的多糖含量在86%～89%之間，取代度在0.665～0.756之間。

2.2 CCK-8法檢測(cè)CMP對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用

2.2.1 CMP樣品對(duì) HepG2 細(xì)胞的抑制作用 如圖2所示，CCK-8法檢測(cè)7個(gè)CMP組分培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24 h后的抑制率。CMP作用細(xì)胞24 h，細(xì)胞抑制率與CMP濃度呈正相關(guān)。當(dāng)CMP為750 μg/mL時(shí)抑制率最高，其中CMP3對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率達(dá)到50.04 %;當(dāng)CMP為5 μg/mL時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率最低，其中CMP7的抑制率僅為4.25%。

2.2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間CMP對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用

如圖3所示，作用48 h和72 h的抑制率差距很小，但明顯高于24 h，表明HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入CMP 48 h后，對(duì)細(xì)胞的抑制率達(dá)到峰值。CMP培養(yǎng)HepG2細(xì)胞48 h時(shí)，CMP7對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率極顯著低于其他CMP組分，抑制率最低僅為45.32 %，CMP3的抑制率最高為75.26 %。24 h時(shí)CMP6對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞的抑制率均與CMP7具有顯著性差異，其他組分CMP為極顯著性差異。不同時(shí)段下，CMP3對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率高于其他組分，最高抑制率為76.05 %。

2.2.3 CMP3對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用 如圖4所示，當(dāng)CMP3作用HepG2細(xì)胞24 h時(shí)，隨著CMP3濃度增加，細(xì)胞抑制率升高呈量—效關(guān)系;48 h和72 h時(shí)，在CMP3濃度低于100 μg/mL時(shí)，抑制率與CMP3濃度呈正相關(guān)，高于100 μg/mL時(shí)，隨著CMP濃度增加，HepG2細(xì)胞的抑制率維持在75%左右。通過SPSS 22.0分析CMP3對(duì)HepG2細(xì)胞在不同時(shí)間的IC50（表2）。CMP3作用HepG2細(xì)胞72、48、24h的IC50分別為26.34、34.06、763.64 μg/mL，48 h和72 h的IC50與24 h相比，具有極顯著性差異時(shí)（P<0.01）。48 h與72 h的IC50相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

本研究采用不同的提取條件，從茯苓中提取了7種不同的CMP組分，并檢測(cè)不同組分CMP含量、取代度及對(duì)HepG2細(xì)胞增殖作用影響。探究不同提取條件、不同CMP組分濃度、不同作用時(shí)間與抑制HepG2細(xì)胞增殖之間的作用關(guān)系。研究表明，CMP的含量與取代度與其抑制HepG2的增殖有密切關(guān)系，CMP3的含量最高為89.27 %，取代度最低為0.665，對(duì)HepG2的生長抑制率最高。NaOH濃度與處理時(shí)間有利于茯苓多糖的提取，但是濃度過高和時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致1，3糖苷鍵被堿解打斷，使得多糖鏈分子變短，從而導(dǎo)致CMP空間構(gòu)象的改變，進(jìn)而影響多糖性質(zhì)與功效。CMP的取代度主要與NaOH/氯乙酸摩爾比和醚化溫度有關(guān)及NaOH濃度與堿化時(shí)間有關(guān)。CMP作用HepG2肝癌細(xì)胞48 h對(duì)其生長抑制效果最佳;CMP3樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率最高達(dá)到76.05 %;CMP3作用于HepG2細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為763.64、34.06、26.34 μg/mL。這為后續(xù)試驗(yàn)CMP對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)。

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Abstract：Objective To study the apoptosis of HepG2 cells in different components of carboxymethytlpachymaram（CMP）.Method CMP of different components was prepared by double alkali addition under different extraction concentration and treatment time.Effects of sulfuric acid - anthrone，titration and CCK-8 on CMP content，degree of substitution and HepG2 cell proliferation were studied.Result Totally 7 components of CMP were obtained，whose polysaccharide content was within the range of 85 %～90 %and degree of substitution was 0.65～0.80.CMP 750 μg/mL had the best inhibitory effect on HepG2 cells at 24 h，and the CMP3 inhibition rate was up to 50.035 %.CMP 750 μg/mL cultured HepG2 cells for 24～72 h had the best inhibitory effect at 48 h，of which CMP3 had the highest inhibitory effect at 76.05 %.The IC50 of CMP3 at 72 h，48h and 24 h was 26.34 μg/mL，34.06 μg/mL and 763.64 μg/mL，respectively.Conclusion CMP can induce the apoptosis of HepG2 cells.Under certain treatment time and concentration，CMP can effectively inhibit the proliferation of HepG2 cells，and its inhibition rate is closely related to the dose-effect and time-effect of concentration，as well as the content and degree of substitution of CMP.

Keywords：different component;carboxymethylpachyman（CMP）;HepG2;cell proliferation（責(zé)任編輯 唐建敏）