李釔，蹇瑜璇，竇 純，吳 璇，閆海洋，袁 媛

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全系，吉林長春 130062）

呋喃（分子式為C4H4O），是一種具有芳香味與低沸點（31℃）的小分子環(huán)狀烯醚，具有高度揮發(fā)性、親脂性且具有毒性。它容易通過生物膜，被肺或腸吸收，可在人體中引起腫瘤或癌變[1]。國際癌癥研究機構(gòu)將呋喃列為可能使人類致癌物質(zhì)的2B組[2]。瑞典公共健康管理局和加拿大等國家的許多研究也發(fā)現(xiàn)了呋喃潛在的致癌危險。美國國家毒理學(xué)計劃研究表明，對于多種器官，呋喃都有較強烈的致癌作用，它可以導(dǎo)致肝臟和腎臟損傷，造成毒性病變，并且它所造成的損傷程度與其劑量成正比。

紅景天藥用歷史久遠(yuǎn)，最早見載于公元1200年的藏醫(yī)《四部醫(yī)典》中，言其“性平、味澀、善潤肺、能補腎、理氣養(yǎng)血”[3]。紅景天苷是藏藥紅景天的主要活性成分，化學(xué)名為對羥基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，苷元為對羥基苯乙醇，即酪醇（Tyrosol）[4]。紅景天苷具有多重生物學(xué)作用，如抗疲勞、抗衰老、抗缺氧作用、心臟保護作用、腦保護作用、神經(jīng)保護作用、保肝護腎、抗肺損傷、皮膚保護等[5-7]。另外，也能清除自由基、抗氧化，具有抗癌和抗細(xì)胞凋亡作用、抗炎和抗毒素作用、抗骨質(zhì)疏松和糖尿病作用。目前已有研究證實紅景天苷對肝臟有一定的保護作用。榮黎等人[8]研究表明，紅景天苷可使大鼠血清肝功指標(biāo)得到改善，降低肝組織丙二醛（Malondialdehyde，MDA） 含量、提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 活性，減輕肝組織病理學(xué)變化。韓洪波等人[9]證實紅景天苷對腎炎大鼠有治療作用。潘志浩等人[10]建立CCl4大鼠肝損傷模型，對病鼠進行紅景天灌胃處理。結(jié)果表明，紅景天苷對抗肝纖維化有一定作用，能夠減緩CCl4對肝臟造成的損傷。

肝臟是機體新陳代謝的中心站，是藥物、氧化性毒物及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物最主要的靶位點，各種物質(zhì)以肝實質(zhì)或非實質(zhì)細(xì)胞作為靶細(xì)胞，激發(fā)細(xì)胞損傷，產(chǎn)生細(xì)胞壞死、凋亡、炎癥、纖維化等一系列病理變化[11]。肝組織HE切片也是判斷肝臟病變及健康狀況的重要材料。

通過研究呋喃和紅景天苷對小鼠肝臟的氧化指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）、MDA、SOD，以及免疫指標(biāo)腫瘤壞死因子 -α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素 -6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-10（interleukin-10，IL-10） 含量變化的影響，結(jié)合肝組織HE切片分析，探究紅景天苷對由呋喃所致的小鼠肝損傷的保護作用，為減輕食品中呋喃在人體內(nèi)產(chǎn)生的損害作用提出新的解決途徑，從而達到提高人體健康水平的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 氧化指標(biāo)測定

丙二醛（MDA）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD） 測定試劑盒、谷胱甘肽-S移換酶（GST）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST） 測定試劑盒。

1.1.2 免疫指標(biāo)測定

小鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）、小鼠白細(xì)胞介素10（IL-10）、小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α） 檢測試劑盒。

1.1.3 蛋白含量測定

總蛋白定量測定試劑盒（BCA），南京建成生物工程研究所提供。

1.1.4 其他

無菌生理鹽水、玉米油、呋喃標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：110-00-9，純度≥99.5%）、紅景天苷 （CAS：10338-51-9，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司提供；25只Balb/c雄性小鼠，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

JD200-3型萬分之一電子天平，北京北德科學(xué)器材有限公司產(chǎn)品；RT-6000型酶標(biāo)分析儀、Spx-250B-Z型37℃恒溫培養(yǎng)箱、HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博訊有限責(zé)任公司產(chǎn)品；MixMax型漩渦混勻器，北京北德科學(xué)器材有限公司產(chǎn)品；LD5-2A型離心機，北京醫(yī)用離心機廠產(chǎn)品；超純水Milli-Q system高壓滅菌鍋；干熱消毒箱；超凈臺。

試驗耗材：1 mL灌胃裝置、1 mL一次性使用無菌注射器、解剖工具、玻璃研磨器、小號鼠籠及給水瓶、移液槍等。

1.3 方法

1.3.1 試驗溶液的配制

（1）空白組試劑的配制。直接取用玉米油和生理鹽水。

（2） 質(zhì)量濃度8 mg/mL呋喃溶液的配制。用萬分之一天平準(zhǔn)確稱量0.06 g呋喃標(biāo)準(zhǔn)品，溶于15 mL玉米油中，混勻，配置成40 mg/mL的溶液，之后取2 mL質(zhì)量濃度40 mg/mL的呋喃加到8 mL玉米油中，混勻，配成質(zhì)量濃度8 mg/mL的溶液，以上操作全部現(xiàn)用現(xiàn)配、冰上操作。

（3） 質(zhì)量濃度40 mg/mL紅景天苷溶液的配制。用萬分之一天平準(zhǔn)確稱量0.06 g紅景天苷，溶于15 mL生理鹽水中，混勻，配制成40 mg/mL的溶液。

（4） 質(zhì)量濃度20 mg/mL紅景天苷溶液的配制。取質(zhì)量濃度40 mg/mL的紅景天苷溶液，加入2倍體積的生理鹽水得到質(zhì)量濃度20 mg/mL的溶液。

（5）質(zhì)量濃度10 mg/mL紅景天苷溶液的配制。取質(zhì)量濃度20 mg/mL的紅景天苷溶液，加入2倍體積的生理鹽水得到質(zhì)量濃度10 mg/mL的溶液。

1.3.2 動物的分組

25只Balb/c雄性小鼠，體重20±3 g，隨機分為5組，每組5只，分別放入5個鼠籠，在溫度為18～22℃，相對濕度為50%～60%的條件下飼養(yǎng)。自由覓食飼養(yǎng)1周，待小鼠完全適應(yīng)環(huán)境后，進行動物試驗。所有的操作和試驗流程均遵守我國《實驗動物管理條例》。

小鼠適應(yīng)環(huán)境后，首先將無菌小鼠隨機分為5組，分別為空白組，呋喃組（8 mg/kg/d），紅景天低（10 mg/kg/）、中（20 mg/kg/d）、高（40 mg/kg/d）劑量組。除空白組用玉米油灌胃外，其余各組均進行呋喃灌胃。采用上述步驟處理15 d后，在每組中隨機取出1只小鼠觀察病變情況，若所取小鼠均病變，則建模成功。若建模失敗，除空白組外各組繼續(xù)用呋喃灌胃15 d，再次檢測，直到建模成功。成功后，每天要進行2次灌胃。空白組作為對照組，要求連續(xù)15 d每天上午用玉米油灌胃，下午用生理鹽水灌胃；呋喃染毒組連續(xù)15 d每天上午用8 mg/mL的呋喃溶液灌胃，下午用生理鹽水灌胃；紅景天苷保護組連續(xù)15 d每天上午用8 mg/mL的呋喃溶液灌胃，下午分別用10，20，40 mg/mL的紅景天苷溶液灌胃。灌胃時間為每天上午8:00-9:00，下午3:00-4:00。試驗期間，每天記錄小鼠的體重，并根據(jù)體重給予呋喃和紅景天苷的劑量，密切觀察小鼠的體型、體重、飲食習(xí)慣和日?；顒拥淖兓闆r。待給藥階段完全結(jié)束后，將所有小鼠麻醉處死，取其肝臟和血液進行指標(biāo)測定。

1.3.3 小鼠處理及血清的制備

試驗進行30 d，最后一次給藥結(jié)束，斷食。12 h后處死小鼠。將小鼠麻醉后，用眼球取血法取小鼠外周血，用EP管收集。將EP管放在4℃環(huán)境中靜置1～2 h，待血清析出后以轉(zhuǎn)速3 000～4 000 r/min，溫度4℃條件下冷凍離心10 min，吸取上層血清部分，于4℃下儲存，待進一步指標(biāo)分析。

1.3.4 小鼠組織勻漿的制備

用脫脊椎法處死小鼠后，立即在超凈工作臺上解剖取出肝臟組織，用生理鹽水洗去表面血跡和雜毛，濾紙擦干后稱質(zhì)量。按肝臟質(zhì)量∶體積=1∶9量取預(yù)冷的生理鹽水，一并加入預(yù)冷的玻璃勻漿機中，冰浴研磨至無組織塊，制成10%的組織勻漿。勻漿放于離心機內(nèi)以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，取上清液待測，若不澄清或澄清不徹底應(yīng)再次離心。

1.3.5 小鼠氧化指標(biāo)的測定

嚴(yán)格按照試劑盒說明測定小鼠肝組織中MDA，SOD，GSH-Px，GST的含量，以評定小鼠氧化損傷狀況。按照試劑盒說明測定小鼠血清中AST，ALT的含量，結(jié)合測定結(jié)果評定小鼠肝臟的健康狀況。

1.3.6 小鼠免疫指標(biāo)的測定

嚴(yán)格按照試劑盒說明測定小鼠血清中的TNF-α，IL-6，IL-10的含量，以評定小鼠免疫功能的變化情況。

1.4 計算

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。試驗數(shù)據(jù)均使用Origin繪圖軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肝組織HE切片及分析

Furan誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果（400×） 見圖1。

圖1 Furan誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果（400×）

中毒等急性病理過程會導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)空泡變性、嗜酸性變、細(xì)胞核異型性、變性壞死等病變情況，根據(jù)不同組別切片中肝臟的病變情況判斷小鼠的肝臟損傷程度，從而探究紅景天苷對呋喃所致肝損傷的保護作用。

空白組小鼠的肝切片出現(xiàn)透明泡，應(yīng)為空泡變性或者脂肪變性，原因可能為空白組小鼠灌胃玉米油造成脂肪攝入過多，無法完全代謝?？瞻捉M大部分肝臟組織健康正常，無其他病變。呋喃染毒組小鼠肝臟切片顯示，肝臟出現(xiàn)脂肪變性或空泡變性，嗜酸性變明顯，炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象突出，并且出現(xiàn)了明顯的組織壞死現(xiàn)象，肝組織損傷情況嚴(yán)重。紅景天苷低劑量組的小鼠肝臟有空泡變性和嗜酸性變，嗜酸性變?nèi)暂^為嚴(yán)重，炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象也十分明顯，但病變情況較呋喃組相比有一定程度的減輕。紅景天苷中劑量組中的小鼠肝切片嗜酸性變，伴有空泡變性和炎細(xì)胞浸潤，炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象仍較明顯，有減輕趨勢。紅景天苷高劑量組小鼠肝切片的嗜酸性變明顯減弱，幾乎消失，炎細(xì)胞浸潤明顯。嗜酸性變與肝臟損傷有關(guān)，損傷程度越深，嗜酸性變得越強烈。呋喃組小鼠的肝臟損傷最強烈，紅景天苷組小鼠肝臟損傷程度隨紅景天苷濃度增高呈降低趨勢。

2.2 小鼠體內(nèi)氧化指標(biāo)的測定結(jié)果及分析

小鼠體內(nèi)氧化指標(biāo)測定結(jié)果見表1。

ALT和AST均為非特異性細(xì)胞內(nèi)功能酶，是臨床上常用的肝功能評價指標(biāo)[12]。ALT和AST主要分布在肝細(xì)胞內(nèi)，正常情況下，二者在血漿中的含量相對穩(wěn)定且較低，但當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生變性或壞死時ALT，AST含量就會升高，其升高的程度與肝細(xì)胞的受損程度相一致[13]，試驗將AST，ALT這2個指標(biāo)作為判斷肝損傷的重要數(shù)據(jù)。由表1可知，呋喃染毒組的小鼠肝臟中AST，ALT含量明顯高于空白組和紅景天苷組。并且隨著紅景天苷濃度的升高，血清中AST和ALT的含量逐漸下降。呋喃染毒組中的AST和ALT水平高，說明呋喃導(dǎo)致肝細(xì)胞膜通透性改變，AST，ALT釋放進入了血漿中，肝組織出現(xiàn)炎癥、腫脹或壞死等損傷現(xiàn)象，而紅景天苷對這一損傷有顯著的保護作用，且這種保護作用隨紅景天苷劑量的增加而增強。

表1 小鼠體內(nèi)氧化指標(biāo)測定結(jié)果

GSH-Px能夠催化還原型谷胱甘肽與ROS反應(yīng)，保護生物膜免受ROS的損害。它還具有保護肝臟、提高機體免疫力的功能。GST是細(xì)胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)。二者含量的下降表明肝臟解毒和抗氧化損傷能力下降，肝臟受損。由表1數(shù)據(jù)計算得，呋喃染毒組的GSH-Px與空白對照組相比下降了47.80%，GST水平下降了57.17%，紅景天苷保護組的GSH-Px和GST水平較呋喃染毒組有所回升，并且回升程度與紅景天劑量有關(guān)。因此，紅景天苷可以通過增加肝臟中GSH-Px，GST的水平，增加生物體抗氧化和解毒的能力，改善由呋喃引起的肝臟氧化損傷。

自由基可與肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等大分子進行共價結(jié)合，干擾蛋白質(zhì)的合成，也可與肝細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)SOD過度消耗，MDA大量產(chǎn)生，同時破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，使膜通透性升高，導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹壞死，肝細(xì)胞破損后釋放ALT，AST滲入血液而活性升高[14-16]。自由基是導(dǎo)致機體氧化損傷的直接原因。MDA為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死。它既能反映體內(nèi)氧化反應(yīng)，也可以作為損害因子對機體造成損傷[17]，因此測定肝臟中MDA的量可以反映出機體氧化損傷的程度。SOD是生物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，能夠清除機體內(nèi)的自由基。SOD首先催化超氧陰離子生成氧氣和過氧化氫，生成的過氧化氫在GSH-Px的催化下轉(zhuǎn)換成H2O和O2[18]。SOD能夠保護細(xì)胞免受損傷，間接地反映了機體清除體內(nèi)氧自由基的能力[19]。由表1可知，呋喃染毒組和紅景天苷保護組的SOD水平顯著低于對照組，MDA水平高于對照組，這說明呋喃使小鼠肝臟受到了一定程度的氧化損傷。在紅景天苷的作用下，小鼠肝臟內(nèi)的SOD水平有所回升，紅景天苷低劑量組中的SOD比染毒組上升了32.83%，紅景天苷中劑量組中的SOD比染毒組上升了54.08%，紅景天苷高劑量組中的SOD比染毒組上升了102.37%。由此可見，紅景天苷可以通過顯著提高肝臟中SOD的水平來清除增多的氧自由基，減緩呋喃引起的肝臟的氧化損傷，且保護作用與紅景天苷劑量呈正相關(guān)。呋喃組MDA水平高，脂質(zhì)過氧化程度增加，肝臟受損。紅景天苷處理后，肝臟MDA濃度顯著降低，且呈現(xiàn)了與劑量的正相關(guān)，說明紅景天苷處理可以有效改善呋喃導(dǎo)致的肝損傷。

2.3 小鼠體內(nèi)免疫指標(biāo)的測定結(jié)果和分析

小鼠血清中TNF-α的含量變化見圖2，小鼠血清中IL-6的含量變化見圖3，小鼠血清中IL-10的含量變化見圖4。

圖2 小鼠血清中TNF-α的含量變化

圖3 小鼠血清中IL-6的含量變化

圖4 小鼠血清中IL-10的含量變化

在肝臟損傷的過程中炎癥被激活是一種常見的病理生理過程[20]。TNF-α，IL-6是重要的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子。TNF-α是一種由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的單核因子，具有促炎作用[21]，是多種信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。IL-6能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能。IL-10是由活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵抗炎細(xì)胞因子[22]，肝臟中許多細(xì)胞都能分泌IL-10，其具有消除炎癥的作用[23]。

由圖2和圖3可知，呋喃染毒組血清中TNF-α，IL-6含量與空白對照組相比，有顯著性增加（p＜0.05）；說明呋喃刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對小鼠機體有一定毒害作用。紅景天苷相關(guān)劑量組中TNF-α，IL-6含量與呋喃組相比，有顯著性減少（p＜0.05），減少程度與紅景天苷劑量成正比。這說明紅景天苷對小鼠血清中TNF-α，IL-6分泌有明顯抑制作用，且抑制作用隨著劑量增高而增強，即紅景天苷能夠抑制呋喃引發(fā)的免疫反應(yīng)。由圖4可知，IL-10作為炎癥與免疫抑制因子，在呋喃染毒組的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于空白組，給予了不同劑量的紅景天苷后，呋喃染毒組的含量上升，說明呋喃可以引發(fā)機體炎癥，而紅景天苷可以通過抑制促炎因子、提高體內(nèi)炎癥抑制因子的分泌來調(diào)節(jié)機體免疫，清除呋喃的損傷作用。

3 結(jié)論

作為食品加工過程中產(chǎn)生的污染物，呋喃具有潛在的致癌性。通過小鼠的肝臟HE切片可知，呋喃的作用能夠使小鼠肝臟發(fā)生氧化損傷，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞空泡變性、嗜酸性變、空化、炎細(xì)胞浸潤和細(xì)胞核異型性，少部分肝臟可能出現(xiàn)組織壞死的現(xiàn)象。給予紅景天苷的小鼠，肝臟的病變情況減輕，且減輕程度與紅景天苷劑量呈正相關(guān)趨勢。這說明紅景天苷能在一定程度上減少呋喃使肝臟發(fā)生的病理性損傷。同時呋喃導(dǎo)致小鼠機體內(nèi)AST，ALT，MDA含量升高，SOD，GSH-Px，GST含量下降，說明呋喃會引發(fā)小鼠肝臟的氧化損傷，相關(guān)抗氧化酶活力降低，清除自由基效率明顯下降。而紅景天苷各劑量組的小鼠中AST，ALT，MDA水平低于呋喃組，SOD，GSH-Px，GST含量有所回升，表明紅景天苷可以減少肝細(xì)胞膜通透性的改變，有效提高了肝臟組織內(nèi)清除自由基的能力，減少肝臟的氧化損傷。

免疫指標(biāo)TNF-α，IL-6，IL-10的變化反映肝臟的免疫狀態(tài)。TNF-α，IL-6是重要的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子。含量越高，免疫強度越大，肝臟受損傷越嚴(yán)重。IL-10是重要的炎癥與免疫抑制因子，含量越低，機體抵抗炎癥侵襲的能力越弱，免疫能力越低下，受損傷越嚴(yán)重。呋喃組小鼠血清中TNF-α，IL-6含量顯著高于空白組，而IL-10含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于空白組，呋喃導(dǎo)致小鼠肝臟受損較嚴(yán)重。然而紅景天苷灌胃小鼠后能明顯抑制淋巴因子TNF-α，IL-6的分泌，促進IL-10的分泌，從而表現(xiàn)出紅景天苷具有明顯調(diào)節(jié)和增強機體免疫力的功能。

小鼠肝臟組織切片、氧化指標(biāo)、免疫指標(biāo)為一個整體，由臟器到分子水平提示紅景天苷對呋喃導(dǎo)致的小鼠肝損傷有一定的保護作用，并且這種保護作用和紅景天苷的劑量呈正相關(guān)關(guān)系。紅景天苷可能通過提高機體抗氧化酶活性，減輕自由基對細(xì)胞膜造成的損傷，同時也有試驗結(jié)果表明紅景天苷可以調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)，因此紅景天苷對由呋喃引發(fā)小鼠肝損傷的保護作用可能是通過多條途徑實現(xiàn)的。