沈淑賢，鄧淋萍，楊靜嫻，何 娣，丘苑新

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225）

0 引言

柚子是蕓香科柑橘屬水果，在我國(guó)廣東、廣西、湖南、臺(tái)灣等地種植非常廣泛。柚子核富含脂肪油和蛋白質(zhì)，含有黃柏酮、黃柏內(nèi)酯、去乙酰鬧米林及檸檬苦素類似物等成分。目前主要提取柚子核中促進(jìn)人體健康及防治一些疾病的非營(yíng)養(yǎng)性生理活性成分[1]。類檸檬苦素是具呋喃環(huán)的三萜類化合物。從柑橘屬植物及相關(guān)植物中已分離出50多種類檸檬苦素，多為會(huì)使柑橘類果汁產(chǎn)生“后苦味”的水不溶性苷元[2]，另有17種無苦味且能溶于水的檸檬苦素類似物配糖體[3]，具有抗癌[4-5]、抗炎[6]、抑菌[7]、鎮(zhèn)痛[8]等多種功效。然而，對(duì)柚籽中檸檬苦素的研究還缺少相關(guān)的報(bào)道。為促進(jìn)柚子核中檸檬苦素的利用，試驗(yàn)以梅州沙田柚柚籽為原材料，在不同條件下亞臨界萃取柚籽油及提取柚籽中的類檸檬苦素，分析其含量得率，從而得出最佳的萃取柚籽油和提取檸檬苦素的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

沙田柚，梅州興寧果園提供；丁烷，河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司提供；無水乙醇、對(duì)二甲氨基苯甲醛，廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司提供；冰醋酸、高氯酸，廣州市錦旺化工有限公司提供；丙酮，廣州市一馬環(huán)?？萍加邢薰咎峁?/p>

YB-700A型高速多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司產(chǎn)品；CBE-10L型亞臨界萃取實(shí)驗(yàn)室成套設(shè)備，河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；RV10型數(shù)顯型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品；FD-2A-50型真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；TU-1810SPC型可見紫外分光光度計(jì)，天津市普瑞斯儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 粗提物的提取

稱取脫脂柚籽粉末2 g于錐形瓶中，加入一定量的一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，恒溫水浴浸泡3 h。過濾上層清液，真空蒸發(fā)濃縮至20 mL左右。將濃縮液冷凍至結(jié)冰。真空冷凍干燥得類檸檬苦素粗提物，采用分光光度法測(cè)定其含量。

1.2.2 紫外分光光度法測(cè)定類檸檬苦素含量

類檸檬苦素含量測(cè)定采用DMAB法[9]。

指示劑：準(zhǔn)確量取冰醋酸100 mL，高氯酸80 mL，制備酸性母液；量取一半酸母液90 mL，添加對(duì)二甲氨基苯甲醛3.33 g，得到DMAB指示劑。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用丙酮定容至25 mL。分別準(zhǔn)確吸取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，2.00 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于1～8號(hào)試管中，丙酮定容至2.0 mL，依次迅速加入3 mL DMAB指示劑和3 mL酸母液，靜置30 min完全顯色后測(cè)量波長(zhǎng)470 nm處的吸光度。分別以檸檬苦素質(zhì)量濃度和吸光度為橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線

用丙酮將各個(gè)工藝條件下得到的類檸檬苦素粗提物粉末定容至10 mL，按照上述同樣的方法測(cè)定其于波長(zhǎng)470 nm處的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和以下公式計(jì)算柚籽中類檸檬苦素含量。

式中：C——吸光度所對(duì)應(yīng)的含量，mg/mL；

V——樣品定容體積，mL；

M——所稱取的脫脂柚籽質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比對(duì)類檸檬苦素粗提物含量的影響，確定影響類檸檬苦素提取率的主要因素。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比為因素，以所提取的類檸檬苦素粗提物含量為測(cè)定指標(biāo)。

乙醇提取柚籽中類檸檬苦素試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 乙醇提取柚籽中類檸檬苦素試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇提取脫脂柚籽中類檸檬苦素的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)類檸檬苦素粗提物含量的影響類檸檬苦素提取含量隨不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)見圖2。

圖2 類檸檬苦素提取含量隨不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷增加，檸檬苦素類化合物的提取效果越好。乙醇體積數(shù)在80%時(shí)，提取效果最好。但體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加提取率會(huì)降低，這可能與乙醇的極性有關(guān)。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。

2.1.2 提取溫度對(duì)類檸檬苦素粗提物含量的影響

類檸檬苦素提取含量隨不同提取溫度的變化趨勢(shì)見圖3。

圖3 類檸檬苦素提取含量隨不同提取溫度的變化趨勢(shì)

由圖3可知，類檸檬苦素粗提物的得率隨溫度升高不斷增加，70℃時(shí)，含量達(dá)到最高峰，之后升高溫度，得率緩慢下降。提高萃取溫度可使分子的熱運(yùn)動(dòng)速度加快，提高溶質(zhì)的溶解度和擴(kuò)散速率。但萃取溫度過高會(huì)導(dǎo)致溶質(zhì)中的熱敏性成分容易被分解破壞[10]、能量消耗過大和操作困難。因此，最合適的提取溫度為70℃。

2.1.3 料液比對(duì)類檸檬苦素粗提物含量的影響

類檸檬苦素提取含量隨不同料液比的變化趨勢(shì)見圖4。

圖4 類檸檬苦素提取含量隨不同料液比的變化趨勢(shì)

由圖4可知，柚籽檸檬苦素粗提物的含量隨料液比的增加而增加，料液比從1∶15增加到1∶35時(shí)，增加速度較快；到1∶35之后，提取率變化不大。因此選擇1∶45的比例更合適。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

乙醇提取柚籽類檸檬苦素粗提物正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 乙醇提取柚籽類檸檬苦素粗提物正交試驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)正交數(shù)據(jù)的直觀分析，比較試驗(yàn)中A，B，C 3個(gè)因素中極差R值的大小，可以看出其影響的主次順序?yàn)镃＞B＞A，即料液比對(duì)柚籽中的檸檬苦素類似物的提取影響最大，其次為提取溫度，乙醇體積分?jǐn)?shù)影響最小。

根據(jù)K值，按照各因素的最好水平選取最優(yōu)的水平組合為A1B2C2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，料液比1∶45。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，柚籽中類檸檬苦素的提取率為3.422 mg/g。

乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比含量趨勢(shì)圖見圖6。

通過圖6可以直觀看出指標(biāo)與3個(gè)因素水平的波動(dòng)關(guān)系，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，檸檬苦素的含量不斷下降，故A1為最優(yōu)水平；隨著提取溫度的升高，檸檬苦素含量先增加至B2水平后降低，故B2為最優(yōu)水平；檸檬苦素含量隨著料液比的增大先上升至C2水平后降低，故C2為最優(yōu)水平；因此，類檸檬苦素的最優(yōu)提取工藝條件是乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，料液比1∶45。

圖6 體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比含量趨勢(shì)圖

3 結(jié)論

在柚籽脫脂的條件下，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對(duì)各個(gè)因素的分析得到柚籽中類檸檬苦素的最佳初提工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度70℃，料液比1∶45。

無水乙醇可以重復(fù)回收利用，綠色無污染，節(jié)約成本，與其他萃取劑相比減少了對(duì)環(huán)境的污染。受試驗(yàn)原材料和器材的限制，萃取劑的用量過于飽和，應(yīng)當(dāng)繼續(xù)減少萃取劑的用量，找到更合適的料液比。通過查閱資料，試驗(yàn)中通過乙醇浸提并沒有把柚籽中的類檸檬苦素完全提取出來，接下來的研究可以嘗試用其他的溶劑進(jìn)行提取或添加水溶助劑、利用超聲波輔助等對(duì)類檸檬苦素進(jìn)行提取。