畢洪書，房 燕，高 珊，楊東娟，石 凱

胰島素-磷脂復合物的制備及其理化性質的研究

畢洪書，房 燕，高 珊，楊東娟，石 凱*

（沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽，110016）

研究胰島素-磷脂復合物的制備及理化性質。采用非水溶劑-冷凍干燥法制備胰島素-磷脂復合物，并對其紅外光譜、X-射線衍射以及表觀油-水分配系數等理化性質進行表征。另外采用降血糖試驗評價磷脂復合胰島素生物活性的變化。通過三相圖的繪制確定復合物形成的較優(yōu)處方和工藝為（質量分數）：二甲亞砜90%～100%，冰醋酸0%～10%，磷脂0%～5%。紅外光譜顯示胰島素與磷脂結構中的某些基團發(fā)生了相互作用，但無新的特征吸收峰產生，即無新共價鍵生成。X-射線衍射分析顯示，復合物呈現(xiàn)無定型特征。復合物中胰島素的表觀油-水分配系數與介質的離子強度及pH值有關，低離子強度和胰島素等電點處的介質pH值有利于復合物在水相中的結合穩(wěn)定性。大鼠降血糖實驗表明，制備工藝對胰島素的生物活性無明顯影響，胰島素復合物組和溶液組對大鼠的降血糖作用無顯著性差異。胰島素與磷脂形成復合物后，其理化性質發(fā)生顯著變化，親脂性增加并能較好地保持其生物活性。

藥劑學；胰島素-磷脂復合物；非水溶劑-冷凍干燥法；胰島素；磷脂；復合物；制備；理化性質

胰島素是胰臟細胞分泌的一種多肽類激素，由于其獨特的降血糖作用，是目前治療Ⅰ型糖尿病的首選藥物。但其具有較高的親水性，且分子量較大，因此不利于通過胃腸道黏膜進入血循環(huán)[1]。為改善藥物的脂溶性，大量的共價修飾手段被采用，以促進胰島素在胃腸道的通透性，提高其生物利用度[2-3]。但共價化學修飾手段通常會改變蛋白質的一級結構并導致其生物活性的損失[4-5]，另外工藝復雜、成本高的因素也使該方法受到很大限制。

為此，作者從藥物的結構入手，探索通過與兩親性物質—卵磷脂形成物理復合物，以期達到提高胰島素的脂溶性和黏膜吸收的目的。對胰島素磷脂復合物的制備條件進行了研究，確立了簡便易行的制備工藝。在此基礎上對胰島素磷脂復合物的光譜學特征、晶體特征、脂溶性以及生物活性等理化性質進行了較為系統(tǒng)、深入的考察，這對預測磷脂復合胰島素與疏水性載體的親和性及其在體內的黏膜滲透性具有重要意義。

1 儀器與材料

IFS-55紅外光譜儀（瑞士Bruker公司），D/MAX-rA型X射線衍射儀（日本理學制作所），Jasco高效液相色譜儀、UV-975紫外檢測器（日本分光公司），SHA-B恒溫振蕩器（常州國化電器有限公司），TDL-40B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），RE-52A旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），F(xiàn)D-1冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)，Kromasil ODS-1色譜柱（C18柱， 200 mm×4.6 mm，5 μm，大連化物所）。

豬胰島素（效價27.5 IU?mg-1，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司），卵磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司），Triton X-100（美國Amresco公司），葡萄糖酶氧化試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司），三氯化鐵（分析純，沈陽試劑五廠），硫氰酸銨（分析純，天津化學試劑公司），乙醇、二氯甲烷、乙醚、乙腈、丙酮、正辛醇、二甲亞砜、冰醋酸等試劑（分析純，市售）。

SD大鼠，雄性，體質量（200 ± 20）g，沈陽藥科大學實驗動物中心提供，動物許可證號 SCXK（遼）2017-0001。

2 方法與結果

2.1 胰島素-磷脂復合物的制備

采用非水溶劑-冷凍干燥法：將胰島素和卵磷脂共溶于二甲亞砜中，并加入微量冰醋酸作助溶劑，將此單相溶液在一定溫度下孵育一定時間后，放入冷凍干燥機內，冷凍干燥12 h得到固體物。

2.1.1 三相圖的繪制及凍干區(qū)域的選擇

將磷脂溶于冰醋酸中，得到不同濃度的溶液；用二甲亞砜滴定此磷脂-冰醋酸溶液，直至出現(xiàn)渾濁，記錄混濁點三組分的質量分數，繪制三相圖（圖1）。

Fig. 1 Three-phase diagram for DMSO/acetic acid/phospholipid mixtures at 25 ℃

渾濁點可用濁度法確定：以相同濃度的磷脂-冰醋酸溶液作空白對照，測定磷脂-二甲亞砜-冰醋酸系統(tǒng)在400 nm可見光處的吸光度值，吸光度值大于0.05即可認為出現(xiàn)渾濁。為確定凍干區(qū)域，將二甲亞砜-冰醋酸系統(tǒng)的-50 ℃可凍區(qū)域同時標在圖1上。從圖1中可以看出，凍干范圍為單相區(qū)與可冷凍區(qū)的重疊部分，即：二甲亞砜質量分數90%～100%，冰醋酸質量分數0～10%，磷脂質量分數0～5%。

2.1.2 投料比對復合物中藥物含量的影響

精密稱取胰島素1.0～5.0 mg與卵磷脂5.0 mg溶于二甲亞砜-冰醋酸混合溶劑中，于30 ℃水浴中攪拌反應30 min，凍干得固體物。然后加入適量二氯甲烷，充分溶解其中的磷脂復合物，離心，收集上清液，減壓蒸發(fā)除去二氯甲烷，收集固體，RP-HPLC法測定胰島素含量[6]，計算胰島素與磷脂的結合比，結果見表1。結果表明：當胰島素與磷脂投料質量比超過2∶5時，復合物中的藥物含量增加不明顯，已達到飽和。故選擇2∶5作為胰島素與磷脂的最佳投料比。

Table 1 Effect of weight ratio of insulin to phospholipid on drug content in the complex

2.2 復合物在水中的分散狀態(tài)

稱取適量胰島素-磷脂復合物，分別分散于10 mL pH值2.0、蒸餾水及pH值7.4緩沖液中，攪拌使分散均勻。于光學顯微鏡下觀察樣品在各分散介質中的外觀狀態(tài)，結果如圖2所示。

Fig. 2 Micrograph of insulin-phospholipid complex dispersed in pH 2.0 buffer(A), water(B) and pH 7.4 buffer(C)

從圖2中可以看出，分散介質的pH值對復合物的分散狀態(tài)有顯著影響。復合物在pH值2.0、蒸餾水及pH值7.4緩沖液中分散后的平均粒徑約為5、4及1 μm。卵磷脂中除主要含有磷脂酰膽堿外，還含有相當部分的酸性磷脂（磷脂酸），因此帶有較多的負電荷。在酸性環(huán)境中磷酸基發(fā)生質子化，負電荷數量降低而使分散顆粒表面電性趨于中性，因此可以聚集導致粒徑增大。而在堿性環(huán)境中，則由于靜電斥力使頭部基團分開，因此分散粒徑較小。

2.3 紅外光譜（IR）分析

采用KBr壓片法分別對胰島素、卵磷脂、胰島素磷脂復合物及物理混合物在500～4 000 cm-1進行紅外掃描，結果見圖3。

Fig. 3 Infrared spectra of phospholipid (a), physical mixture (b), complex (c) and insulin (d)

圖3中卵磷脂與胰島素混合物的IR（b曲線）基本是該兩組分各自IR的疊加，其中：卵磷脂1 500～700 cm-1的吸收峰被胰島素相應范圍內較寬的吸收峰所掩蓋而形成較寬的峰體，但其1 462 cm-1和1 087cm-1處的特征吸收峰仍能找到；而1 737 cm-1和1 652 cm-1處的特征吸收峰則因與胰島素1 660 cm-1和1 537 cm-1處的特征吸收峰靠得較近而相互重疊在一起，形成混合物IR中1 726 cm-1和1 645 cm-1兩處特征吸收峰。胰島素磷脂復合物的IR（c曲線）則與混合物的IR明顯不同，其中胰島素的1 660 cm-1（-NH）吸收峰和磷脂1 737 cm-1（νC=O）、1 232 cm-1（νP=O）吸收峰的形狀和強度均發(fā)生了一定的變化，說明胰島素結構中的—NH2與磷脂分子中的極性磷酸基團發(fā)生了相互作用。卵磷脂1 737 cm-1（νC=O）吸收峰發(fā)生變化說明胰島素分子有可能與其脂肪酸鏈產生了疏水相互作用。在胰島素磷脂復合物的紅外圖譜中未出現(xiàn)新的特征吸收峰，表明兩者之間沒有形成共價鍵，未產生新的化合物，而是以物理相互作用結合的復合物。

2.4 X-射線衍射分析

分別將胰島素、卵磷脂、胰島素磷脂復合物及相同質量比的胰島素磷脂物理混合物進行X-射線衍射分析。檢測條件：石墨單色器單色化CuKα輻射，管電40 kV，管流60 mA，衍射范圍5o<2<50o。分別對胰島素、卵磷脂、胰島素磷脂復合物及物理混合物進行X-射線衍射分析，結果見圖4。

圖4所示的X-射線衍射譜（a曲線）中，豬胰島素在2<20o內有許多尖峰，其后出現(xiàn)一個大而寬的彌散峰，表明本實驗所用的豬胰島素為晶體和無定形的混合態(tài)；而卵磷脂（b曲線）則具有典型的無定形的特征，這與文獻報道是一致的[7-8]。在胰島素與卵磷脂的物理混合物的衍射圖譜（c曲線）中仍能觀察到胰島素的晶體衍射峰，只是數量有所減少，強度也有所減弱。而在相同配比的胰島素與磷脂復合物的衍射圖譜中（d曲線），胰島素的晶體衍射峰完全消失，使得該復合物呈現(xiàn)出無定型特征。

Fig. 4 X-ray diffraction patterns of insulin (a), phospholipid (b), their physical mixture (c) and complex (d)

2.5 復合物中胰島素表觀油/水分配系數的測定

采用搖瓶法測定[9]：分別配制pH值2.0、pH值5.0、pH值7.4磷酸鹽緩沖液以及雙蒸水。精密稱取處方量的胰島素磷脂復合物，分別溶于上述水溶液飽和的正辛醇中，然后加入等體積的正辛醇飽和的相應水溶液，于25 ℃下置于恒溫振蕩器中振搖24 h，靜置30 min，吸取下層水溶液，稀釋后RP-HPLC法測定胰島素含量。按下式計算表觀油水分配系數，結果見表2。

其中，正辛醇為正辛醇相中胰島素的質量濃度（mg?L-1），水為水相中胰島素的質量濃度（mg?L-1），0為分配前正辛醇相中胰島素的質量濃度（mg?L-1）。

Table 2 Apparent partition coefficient of insulin complex with phospholipid in the system of n-octyl alcohol and water (n=3)

2.6 胰島素-磷脂復合物降血糖活性考察

將胰島素及胰島素磷脂復合物分別用含質量分數1% Triton X-100的pH值7.4磷酸鹽緩沖液溶解并配制成71.4 mg?L-1的溶液(相當于2 IU?mL-1)。取禁食過夜的大鼠分為2組，每組5只，分別皮下注射供試溶液0.1 mL（相當于1.0 IU?kg-1）。給藥后30、60、120和180 min從眼角靜脈叢取血0.3 mL，5 000 r?min-1離心5 min，取20 μL血漿，用葡萄糖氧化酶法測定血糖濃度，計算不同時間的血糖濃度占初始血糖濃度的百分率。大鼠皮下注射胰島素溶液及胰島素磷脂復合物后血糖濃度及降糖變化百分率如圖5所示。

結果表明，胰島素溶液與復合物皮下注射后大鼠血糖濃度迅速下降，60 min達到血糖最低點，分別為初始血糖的28.53%和34.47%。兩組樣品對正常大鼠血糖均有明顯的降低作用，在同等劑量下作用強度差異無顯著意義(>0.05)。

—Native insulin; —Insulin complex

3 討論

a. 胰島素分子量大、親水性強及分子間易于聚集的本質極大地阻礙了其口服吸收效率。卵磷脂含有豐富的磷脂酰絲氨酸及磷脂酸等帶有大量的負電荷酸性磷脂，可在一定條件下與胰島素肽鏈N末端-氨基及側鏈-氨基等堿性基團形成離子對復合物。復合物的形成可改善親水性生物大分子的脂溶性并防止分子間聚集，提高小腸上皮細胞脂質雙分子層的滲透能力，從而有利于藥物的吸收[10]。

b. 目前國內外文獻報道的有關天然活性成分磷脂復合物的制備大多是在非質子傳遞溶劑中進行，如丙酮、四氫呋喃、二氧六環(huán)等[11-12]。但胰島素是一種生物活性大分子，其對外界環(huán)境非常敏感，與這類非水有機溶劑接觸很容易失去活性[13]。由于二甲亞砜的生物相容性比較好，它是生命科學領域中常用的細胞、蛋白質等生物活性物質的冷凍保護劑；而且由于二甲亞砜具有較高的凝固點（18.4 ℃），且對胰島素溶解性非常好，因此選擇二甲亞砜作為溶劑系統(tǒng)，并采用冷凍干燥法除去有機溶劑。大鼠降血糖試驗結果初步證明該法制備的復合物不會影響胰島素的生物活性。

c. 胰島素與磷脂之間主要通過分子間疏水作用等非共價鍵形成復合物。胰島素分子中含有大量的疏水殘基，如Phe、Tyr、Val等，在三級結構中這些疏水性基團都被包圍在分子內部，而Gly等親水基分布在分子表面，使整個胰島素分子呈現(xiàn)親水性質。當胰島素分子中引入四氫呋喃、二甲亞砜等非質子有機溶劑后，胰島素肽鏈被打開而使大量疏水殘基外露，從而可與磷脂分子的疏水碳鏈相互結合。值得注意的是，胰島素的疏水內核被打開后有可能造成其生物活性的不可逆損失。二甲亞砜具有良好的生物相容性，文獻報道二甲亞砜雖可暫時改變胰島素的構象，但除去后胰島素的構象又會重新恢復[14]。作者在大鼠降糖試驗中也初步證明了冷凍干燥除去二甲亞砜后，胰島素的活性沒有發(fā)生顯著變化。

d. 復合物中胰島素在pH值5.0磷酸鹽緩沖液-正辛醇系統(tǒng)和雙蒸水-正辛醇系統(tǒng)中的表觀油/水分配系數較大，而在pH值2.0和7.4磷酸鹽緩沖液中的表觀油/水分配系數則較小。這表明胰島素磷脂復合物在水溶液中的結合穩(wěn)定性與介質的離子強度及pH有關。低離子強度有助于胰島素與磷脂的結合，而緩沖液中的離子強度則會大大削弱兩者之間的相互作用。另外，接近胰島素等電點(pI 5.3)處的pH有利于磷脂與胰島素的結合穩(wěn)定性。

e. 本實驗中制備的復合物是載有胰島素的生物制劑，其生物活性穩(wěn)定性是評價該類制劑穩(wěn)定性的一個重要指標，小鼠血糖法[15]測定制劑中胰島素的生物效價變化是評價胰島素活性穩(wěn)定性的一個最可靠的指標。由于本法較為繁瑣，且耗資大，故本實驗中采用正常大鼠為研究對象，評價皮下給藥1 h后，制劑對正常大鼠的降血糖作用強度，從而間接反映制劑中胰島素生物活性的變化。

[1] Mitragotri S, Burke P A, Langer R. Overcoming the challenges in administering biopharmaceuticals: formulation and delivery strategies[J]. Nat Rev Drug Discov, 2014, 13 (9): 655-672.

[2] Hashizume M，Douen T，Murakami M，et al. Improvement of large intestinal absorption of insulin by chemical modification with palmitic acid in rats[J]. J Pharm Pharmcol, 2011, 44 (7): 555-559.

[3] Lee E, Lee J, Jon S. A novel approach to oral delivery of insulin by conjugating with low molecular weight chitosan [J]. Bioconjug Chem, 2010, 21(10): 1720-1723.

[4] Chaturvedi K, Ganguly K, Kulkarni A R, et al. Oral insulin delivery using deoxycholic acid conjugated PEGylated polyhydroxybutyrate co-polymeric nanoparticles[J]. Nanomedicine, 2015, 10(10): 1569-1583.

[5] 崔福德, 石凱, 寸冬梅. 蛋白多肽類藥物納米粒口服給藥系統(tǒng)的研究進展[J]. 沈陽藥科大學學報, 2010, 27(12): 946-951.

[6] 吳珊珊, 熊富良, 宋豪源, 等. 羧甲基殼聚糖-聚乙二醇作為胰島素載體的研究[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2017, 37(10): 906-910.

[7] Singh C, Bhatt T D, Gill M S, et al. Novel rifampicin-phospholipid complex for tubercular therapy: synthesis, physicochemical characterization andevaluation[J]. Int J Pharm, 2014, 460(1/2): 220-227.

[8] 單鳳英, 鐘瑩, 宋旭, 等. 白藜蘆醇磷脂復合物制備工藝的優(yōu)化及理化性質的研究[J]. 華西藥學雜志, 2014, 29(3): 241-244.

[9] 熊耀坤, 梁爽, 杜焰, 等. HPLC法測定洋川芎內酯Ⅰ的平衡溶解度和表觀油水分配系數[J]. 藥物分析雜志, 2012, 32(9): 1644-1647.

[10] OLIVEIRA M S, GOULART G C A, FERREIRA L A M, et al. Hydrophobic ion pairing as a strategy to improve drug encapsulation into lipid nanocarriers for the cancer treatment[J]. Expert Opin Drug Del, 2016, 14(8): 983-995.

[11] Li F, Yang X, Yang Y, et al. Phospholipid complex as an approach for bioavailability enhancement of echinacoside[J]. Drug Dev Ind Pharm, 2015, 41(11): 1777-1784.

[12] Fong S Y, Brandl M, Bauer-Brandl A. Phospholipid-based solid drug formulations for oral bioavailability enhancement: A meta-analysis[J]. Eur J Pharm Sci, 2015, 80: 89-110.

[13] Wang W, Martin-Moe S, Pan C, et al. Stabilization of a polypeptide in non-aqueous solvents[J]. Int J Pharm, 2008, 351(1/2): 1-7.

[14] Snavely W K, Subramaniam B, Rajewski R A, et al. Micronization of insulin from halogenated alcohol solution using supercritical carbon dioxide as an antisolvent[J]. J Pharm Sci, 2002, 91(9): 2026-2039.

[15] 李湛軍.《中國藥典》胰島素生物測定簡化方法及其快速檢測的研究[J]. 中國藥品標準, 2012, 13(5): 336-340.

Study on the preparation and physicochemical properties of insulin-phospholipid complex

BI Hongshu, FANG Yan, GAO Shan, YANG Dongjuan, SHI Kai*

(,,110016,)

To study the preparation and physicochemical properties of insulin-phospholipid complex.The insulin-phospholipid complex was prepared by non-aqueous solvent-freeze drying method, and its physical and chemical properties and apparent oil/water partition coefficient were characterized by infrared spectrum and X-ray diffraction. In addition, the hypoglycemic test was used to evaluate the changes in the biological activity of phospholipid-insulin complex.Through drawing the three-phase diagram, it is determined that the preferred formulation and process of the composite formation are: DMSO 90%-100%, glacial acetic acid 0-10%, and phospholipid 0-5%. Infrared spectra analysis showed that the interaction between insulin and phospholipid in the complex existed, but no new characteristic absorption peaks were observed, which indicated that no new covalent bonds were formed. X-ray diffraction analysis exhibited that the complex was in an amorphous form. The apparent partition coefficient of insulin complex with phospholipid was related to the ionic strength and pH of aqueous dispersion medium. Low ionic strength and pH closed to the isoelectric point of insulin will be favorable to the binding stability of complex. The hypoglycemic experiment in rats showed that the preparation process had no significant effect on the biological activity of insulin. There was no significant difference in the hypoglycemic effect between the insulin complex group and the solution group.After forming the complex of insulin and phospholipids, the physical and chemical properties of insulin change significantly, especially the lipophilicity increases and the biological activity is better maintained.

pharmaceutics; insulin-phospholipid complex; non-aqueous solvent freeze drying method; insulin; phospholipid; complex; preparation; physicochemical properties

R94

A

（2019）05–0149–08

10.14146/j.cnki.cjp.2019.05.001

2018-04-09

國家自然科學基金資助項目（31671020）

畢洪書(1976-), 女(漢族), 河北遵化人, 碩士研究生, E-mail bhongshu@163.com;

石凱(1977-), 男(漢族), 遼寧新金人, 教授, 博士, 主要從事蛋白質藥物納米給藥系統(tǒng)的研究, Tel. 024-43520557, E-mail ashikai@163.com。

(本篇責任編輯：趙桂芝)