李東芹 佘廣彪

摘要 [目的]建立茶葉中茶多酚、生物堿及茶氨酸的質(zhì)譜分析方法。[方法]采用Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱，甲醇、水梯度洗脫20 min進(jìn)行色譜分離；在質(zhì)譜正離子模式下，用多反應(yīng)監(jiān)測離子對(duì)（MRM）模式進(jìn)行定量分析。[結(jié)果]可在20 min內(nèi)同時(shí)定量9種茶多酚、生物堿和茶氨酸。[結(jié)論]該方法靈敏、準(zhǔn)確、選擇性高，適應(yīng)于茶葉中茶多酚、生物堿和茶氨酸的快速定量分析。

關(guān)鍵詞 茶葉；茶多酚；生物堿；茶氨酸；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào) TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）08-0195-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.051

Abstract [Objective]The research aimed to establish a mass spectrometric analysis method for tea polyphenols，alkaloids and theanine in tea.[Method]The column was separated by a Shimpack VPODS （150 L×2.0 mm，5 μm） column and eluted with methanol and water for 20 min.[Result]Quantitative analysis was performed using the multiple reactions monitoring （MRM） mode in mass spectrometry positive ion mode.[Result]The method could quantitate 9 kinds of theanine，tea polyphenols and Alkaloids in 20 min.[Conclusion]The method is rapid，accurate and selective，it can be used to quantitate theanine，tea polyphenols and alkaloids rapidly in tea.

Key words Tea；Tea polyphenols；Alkaloids；Theanine；Liquid chromatographytandem mass spectrometry

茶葉中含有非常豐富的營養(yǎng)成分和藥效成分，是人們?nèi)粘Ｉ钪凶畛ｏ嬘玫摹敖】碉嬃稀薄?茶葉中含有300多種對(duì)人體有益的化學(xué)成分，包括氨基酸、茶多酚、生物堿、維生素等[1]。茶葉中氨基酸的主要成分為茶氨酸和谷氨酸；茶葉藥效功能的主要成分為茶多酚，約占茶葉干重的18%～36%，而茶多酚又以兒茶素類為主[2]。兒茶素類主要組成成分為表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）。茶多酚具有抗氧化、抗血栓、抑制細(xì)菌、提高人體免疫力等功效[3]，已有的科學(xué)研究證明茶多酚對(duì)老年癡呆、糖尿病和乳腺癌具有防治和抑制作用[4-6]。前人的研究主要集中在液相色譜分析方法[7-9]或者某一類化合物的研究[10-13]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法應(yīng)用的比較少[14-15]。筆者利用液相色譜質(zhì)譜高靈敏、高選擇性的分析特點(diǎn)，建立同時(shí)定量茶葉中主要化學(xué)成分的分析方法，可為茶葉品質(zhì)分析或藥用價(jià)值開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。安吉白茶、鐵觀音和紫娟茶葉鮮樣于2017年5月采自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)郭河品種茶園，采摘部位為一芽二葉。華農(nóng)綠針為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生產(chǎn)的商業(yè)成品綠茶；貢品大紅袍為福建省武夷山市慧苑巖茶科學(xué)技術(shù)研究所研制的半發(fā)酵烏龍茶，市面采購；松峰茶為湖北省赤壁市羊樓洞茶葉有限公司生產(chǎn)的綠茶，市面采購。

1.1.2 儀器。

日本島津LC-20AD 液相色譜儀，島津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱；美國AB Sciex 公司API 4000 Qtrap 串聯(lián)三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀；Millipore 超純水儀（Millipore公司）；萬分之一天平（梅特勒公司）；蠕動(dòng)泵（Hamilton公司）。

1.1.3 試劑。乙腈（Merk，色譜純）；超純水；乙酸（色譜純）；1 mL 醫(yī)用注射器；0.22 μm過濾頭（有機(jī)相，津騰牌）；谷氨酰胺、谷氨酸、茶氨酸、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、可可堿及咖啡堿均為西格瑪公司色譜純?cè)噭?，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶食學(xué)院趙劍教授提供。

1.2 樣品處理方法

1.2.1 茶葉鮮樣。精確稱取0.035 g茶葉鮮樣干粉，加5 mL 80%的甲醇水溶液，冰浴超聲提取30 min，然后離心取上清，經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾，稀釋100倍后進(jìn)樣分析。

1.2.2 商品茶葉。精確稱取0.15 g商品茶葉，加50 mL沸水浸泡40 min，然后離心取上清，經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾，稀釋10倍后進(jìn)樣分析。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件。島津Shim-pack VP-ODS（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱，樣品室溫度為室溫；流動(dòng)相：A為0.1%的乙酸水溶液（V/V），B為0.1%的乙酸的甲醇溶液（V/V）；流速為0.25 mL/min。梯度洗脫條件為：0～4.0 min，10%的B；4.1～10.0 min B從10%升至100%，10.0～15 min為100%的B，15.01～20.00 min為10%的B。柱溫箱溫度為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件。采用電噴霧（ESI）離子源，在正離子電離模式下選用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子對(duì)掃描模式進(jìn)行定量分析。電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度500 ℃；離子源輔助氣GS1/GS2氣流均為50 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化 將各化合物標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇水配制成100 μg/L左右的溶液。用針泵注射器以10 μL/min的速度直接進(jìn)到質(zhì)譜儀。先用質(zhì)譜Q1全掃描模式，在分子量100～500 Da掃描確定化合物的Q1母離子，同樣電壓下比較正負(fù)離子模式下母離子的強(qiáng)度，確定正離子電離模式信號(hào)較高，然后再優(yōu)化DP電壓。再在子離子掃描模式下，對(duì)Q1母離子進(jìn)行打碎，優(yōu)化碎裂能量（CE），使各子離子碎片和母離子信號(hào)強(qiáng)度比例最優(yōu)。從化合物的二級(jí)質(zhì)譜碎片中（圖1），選取信號(hào)強(qiáng)度最高的子離子作為Q3，與母離子Q1組成定量分析的特征離子對(duì)MRM進(jìn)行定量分析，各化合物MRM離子對(duì)參數(shù)及選擇離子流色譜圖見圖2和表1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和檢出限

分別稱取各化合物標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，用80%甲醇/水（V/V）定容為100 mL的混合母液。 繼續(xù)用水溶液稀釋成250、125、62.5、31.25、15.6 μg/L的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。在“1.3”試驗(yàn)條件下上機(jī)分析，以各化合物的濃度為橫坐標(biāo)x、相應(yīng)峰面積為y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表1）。

2.3 回收率試驗(yàn)

因茶葉樣品中的兒茶素在熱水浸提過程中有相互轉(zhuǎn)化，因此做加標(biāo)回收試驗(yàn)沒有太大的意義[10]。

2.4 茶葉樣品定量分析 將安吉白茶、鐵觀音和紫仙3種茶葉鮮樣粉末分別稱取2份，按“1.2.1”方法處理后上機(jī)分析，得到各化合物含量見表2。分別稱取市售商品茶葉華農(nóng)綠針、貢品大紅袍、松峰茶2份，按“1.2.2”方法處理后上機(jī)分析，得到各化合物含量見表3。

從表2可看出，同一品種茶葉中各化合物含量有顯著差異；不同茶葉品種之間各化合物含量差別比較大，基本規(guī)律是EGCG含量最高，ECG或茶氨酸其次。從表3和表2數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，商品茶中各化合物的含量除了可可堿都遠(yuǎn)低于新鮮茶葉，應(yīng)該是商品茶不同配方和加工過程中損失造成的。無論是新鮮茶葉還是商品茶葉，都未檢測到茶葉堿，可能是因?yàn)楸旧砗刻图扒疤幚頁p失導(dǎo)致未能檢出。

3 結(jié)論與討論

該研究建立的多種茶多酚、茶氨酸和生物堿的質(zhì)譜檢測方法，可在20 min內(nèi)定量出茶葉中9種主要化合物的含量。該方法與常用的高效液相色譜方法相比，靈敏度和選擇性有顯著提高；質(zhì)譜檢測的高選擇性有效降低了基質(zhì)干擾，提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確度；每個(gè)化合物MRM離子對(duì)都有單獨(dú)的檢測通道，即使2種化合物保留時(shí)間完全一樣也不會(huì)影響其峰面積定量。該方法可適用于茶葉研究中茶多酚、生物堿和茶氨酸的快速定量分析。 參考文獻(xiàn)

[1]宛曉春.茶葉生物化學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：32-34.

[2] 楊成對(duì)，張經(jīng)華，宋莉暉，等.四種茶中茶多酚成分分析[J]. 食品科學(xué)，2009，30（18）：307-309.

[3] 范海濤，劉莊，張照康，等.一種毛尖茶葉多糖MTP06的提取分離及其活性測定[J].茶葉科學(xué)，2016，36（5）：531-536.

[4] 魏然，徐平，應(yīng)樂，等.茶多酚對(duì)阿爾茨海默病的防治功能與機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué)，2016，36（1）：1-10.

[5] 高媛圓，毛立民，徐平，等.茶多酚防治2型糖尿病的分子機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué)，2015，35（3）：239-247.

[6] 喬如穎，李明，鄭新強(qiáng)，等.茶葉及其兒茶素類對(duì)乳腺癌的抑制作用[J].茶葉科學(xué)，2016，36（6）：557-566.

[7] 郭穎，陳琦，黃峻榕，等.超高效液相色譜法測定茶葉中沒食子酸、咖啡堿和兒茶素含量[J].食品科技，2015，40（11）：296-300.

[8] 曾秋梅，梁杏秋，王曉琴，等.RP-HPLC-DAD 法測定茶葉籽油酚類化合物[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2017，32（4）：141-146.

[9] 戴軍，王洪新，陳尚衛(wèi)，等.茶葉及茶多酚中兒茶素的高效液相色譜分析方法研究[J].色譜，2001，19（5）：398-402.

[10] 郭穎，黃峻榕，陳琦，等.茶葉中兒茶素類測定方法的優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2016，37（6）：137-141.

[11] 金鈺，周有祥，胡定金，等.湖北不同地區(qū)綠茶中兒茶素與咖啡因含量比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，56（23）：4588-4590.

[12] 董占波，許金偉，張星海，等.平陽早香茶與平陽黃湯主要品質(zhì)成分分析[J].廣州化工，2017，45（21）：109-111.

[13] 黃正安.飲品茶類化學(xué)成分與藥理作用的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與健康研究， 2017，1（6）：151-152.

[14] 王虹，康海寧，陳軍輝，等.HPLC-APCI-MS 法測定茶葉中的茶氨酸[J].茶葉科學(xué)，2008，28（6）：20-26.

[15] 賴國銀，王俐娟，盧鶴，等.超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜定性研究茶葉籽中的酚類化合物[J].色譜，2017，35（5）：502-508.