馬鑫鑫，崔 寧，歷成海，黃慶華，梁立生，楊少華，趙孝民，許傳田*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271018；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南250100；3.山東日照東港區(qū)南湖鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東日照276817)

H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于低致病性，但能引起家禽較為嚴重的疫病，特別是混合感染會導致較高的死亡率。H9N2 AIV又能作為其它亞型流感病毒的供體，形成新的重組病毒[1-2]。目前國內(nèi)防控H9N2 AIV主要措施是接種疫苗，由于沒有活疫苗，僅僅接種H9N2 AIV滅活疫苗的家禽臨床保護效果不理想，因此研制一種高效的H9N2禽流感疫苗顯得尤為重要[3]。

冷適應是一種較為安全的致弱方法，既保留良好的抗原性，又刺激機體產(chǎn)生粘膜免疫、細胞免疫和體液免疫[4]，但是關于冷適應疫苗的免疫保護機制尚不明確。本研究以一株H9N2 AIV為母本病毒，培育了一株冷適應病毒株，研究其生物學特性，并評價其對SPF雞的免疫效力，進一步通過熒光定量RT-qPCR分析冷適應株在SPF雞胚中復制能力，以及6種細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，初步評價了H9N2 AIV冷適應株的免疫應答反應。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 H9N2 AIV分離株A/Chicken/Shandong/903/2013(CK/903/2013)和A/Chicken/Shandong/1167/2015(CK/1167/2015)，由山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所禽病室保存，兩株病毒均屬于H9 4.2.5.1分支。10日齡SPF雞胚購自山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF雞場。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Genstar公司；去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、RNAiso Plus、TB GreenTMPremix ExTaqTM試劑均購自TaKaRa公司。

1.2 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank登錄的IL-1β、IL-6、IL-12、IL-8、MDA5、OAS、β-actin、H9N2 AIV HA基因的序列，利用Primer 6.0軟件設計特異引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表 1)。

1.3 冷適應株培育 CK/903/2013作為冷適應傳代毒株，在SPF雞胚連續(xù)傳代，雞胚培養(yǎng)溫度由37℃逐漸降低到27℃，每降1℃，傳代3次，27℃～25℃，每降0.5℃，傳代5次，最后用有限稀釋法在25℃將雞胚純化30代，使其能夠穩(wěn)定復制，即獲得冷適應株，命名Ca30。

1.4 冷適應株基因穩(wěn)定性突變分析 利用RNAiso Plus試劑分別提取CK/903/2013病毒、純化后的10代、20代和30代Ca30株病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄后以其為模板，利用特異性引物分別擴增HA基因。PCR反應條件為 95℃ 5 min；95℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃1 min 30 s，72℃10 min，30個循環(huán)。電泳分析擴增結(jié)果后膠回收目的條帶，連接至pMD18-T載體，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，分析冷適應株的氨基酸穩(wěn)定性突變。

1.5 冷適應株病毒的冷適應性檢測 將冷適應病毒Ca30和CK/903/2013株用含雙抗的PBS稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-107 個 稀 釋 度 ，分別接種于10日齡SPF雞胚，每個稀釋度0.2 mL/胚，各接種5個SPF雞胚，分別于不同溫度(25℃、31℃、35℃、37℃)孵育，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，接種72 h后檢測雞胚尿囊液HA血凝效價，根據(jù)Reed-Muench法計算病毒的雞胚半數(shù)感染量(Egg infectious dose，EID50)，評價冷適應株病毒的冷適應性。

1.6 冷適應株動物感染實驗 將CK/903/2013和Ca30病毒株的尿囊液經(jīng)PBS稀釋，以0.2 mL(106EID50/0.2 mL)的劑量經(jīng)鼻腔接種1周齡SPF雞[5]，感染后1 d、3 d、5 d、7 d采集其口腔棉拭子、泄殖腔棉拭子，以及肺臟、喉氣管等內(nèi)臟器官，將采集的棉拭子和內(nèi)臟器官經(jīng)常規(guī)處理后分別接種于10日齡SPF雞胚檢測排毒載毒情況。Ca30組接種后1周、2周、3周、4周、5周采血，分離血清，分別用Ca30、母本CK/903/2013病毒株和異源CK/1167/2015病毒株的尿囊液配制4單位抗原，通過血凝抑制試驗(HI)測定血清轉(zhuǎn)陽的情況。

1.7 qPCR檢測冷適應株Ca30在雞胚中的復制情況 用106EID50/200 μL的Ca30接種10日齡雞胚30枚，200 μL/胚，PBS接種60枚10日齡雞胚作為空白對照[6]。將雞胚置于25℃培養(yǎng)，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，分別于接種病毒后8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h各收集3枚雞胚的尿囊液、心臟、肝臟、肺臟和腦組織，利用RNAiso Plus提取RNA，取1 μg RNA經(jīng)去基因組反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，采用文獻[6]方法，利用qPCR檢測各內(nèi)臟器官病毒復制水平。雞胚尿囊液病毒拷貝數(shù)通過外部基因熒光素酶基因(Luciferase)和M基因進行相對定量的校正。

1.8 qPCR檢測冷適應株Ca30接種雞胚后的各臟器細胞因子轉(zhuǎn)錄水平 收集1.7中各時間點臟器組織研磨，按RNAiso Plus試劑說明書提取病毒RNA，取1 μg RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其cDNA為模板，利用表1中引物，qPCR[6]檢測各臟器的6種細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。各基因的轉(zhuǎn)錄水平以β-actin為內(nèi)參基因，利用公式2-△△CT對各細胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行計算，計算每個時間點3枚雞胚(n=3)的平均值和標準差。

表1 擴增細胞因子及HA基因的引物序列Table 1 Primer sequence for amplification of cytokines and HA gene

2 結(jié)果

2.1 H9N2 AIV冷適應株Ca30 HA基因序列分析為了測定冷適應株Ca30的適應性突變特征，通過測序獲得CK/903/2013原代、純化后的10代、20代和30代冷適應株的HA基因全序列，并分析HA基因編碼的氨基酸突變情況，結(jié)果顯示，冷適應株從第10代開始已經(jīng)獲得大部分的穩(wěn)定氨基酸突變，其中第164位氨基酸由母本病毒株的Q突變?yōu)榈?0代的R，至第20代獲得穩(wěn)定突變L。至此，20代與30代的氨基酸突變位點全部一致(表2)。表明冷適應病毒株Ca30獲得穩(wěn)定的氨基酸突變。

2.2 H9N2 AIV冷適應株Ca30獲得冷適應特性的檢測結(jié)果 將不同稀釋度的冷適應病毒Ca30和CK/903/2013病毒株分別接種SPF雞胚后分別置于不同的溫度進行病毒增殖，HA血凝效價檢測結(jié)果顯示：冷適應病毒在25℃病毒效價為9 log2，EID50值為10-8.25/0.2 mL，隨著溫度的升高病毒HA效價逐漸降低，37℃時冷適應病毒失去復制能力，而CK/903/2013病毒在37℃的EID50值為109.75/0.2 mL，隨著溫度的降低，該病毒HA效價逐漸降低，25℃時CK/903/2013病毒失去復制能力(表3)。表明冷適應病毒具備在低溫下復制的能力。

表2 H9N2 AIV冷適應株Ca30的氨基酸穩(wěn)定性突變結(jié)果Table 2 Amino acid mutation of cold-adapted HPN2 strain Ca30

表3 H9N2 AIV CK/903/2013及其冷適應株Ca30在不同溫度下的HA效價和EID50測定結(jié)果Table 3 HA titer and EID50of H9N2 AIV CK/903/2013 and the Ca30 cultured at different temperatures

2.3 H9N2 AIV冷適應株Ca30動物感染實驗結(jié)果檢測結(jié)果 將CK/903/2013和Ca30株病毒經(jīng)鼻腔接種1周齡SPF雞，進行排毒、臟器載毒量以及血清轉(zhuǎn)陽情況的測定。結(jié)果顯示，Ca30組SPF雞僅在病毒感染3 d后的口腔棉拭子和喉氣管中檢測到排毒，而CK/903/2013組SPF雞在病毒感染1 d后就能在喉氣管和口腔棉拭子中檢測到病毒，且持續(xù)時間較長。CK/903/2013僅在1 d后的肺臟中復制，而Ca30病毒株不能在肺臟中復制(表4)。血清HI抗體檢測顯示，Ca30病毒株接種后3周針對母本病毒和異源病毒CK/1167/2015的HI效價達到最大值，分別為8 log2和5.2 log2，接種后4周針對母本病毒的HI效價達到峰值7.2 log2(圖1)。表明相比于 CK/903/2013，Ca30病毒排毒較少，病毒在喉氣管中低水平復制，并且冷適應病毒能夠激發(fā)機體產(chǎn)生較好的免疫應答，具有良好的免疫原性。

2.4 Ca30株病毒在雞胚尿囊液和各內(nèi)臟器官中的增殖情況 將Ca30株接種SPF雞胚，利用qPCR檢測不同時間點病毒在尿囊液和內(nèi)臟器官中的增殖情況，結(jié)果顯示SPF雞胚接種Ca30株36 h后開始在雞胚尿囊液中復制，在60 h達到復制高峰。在心臟和肺臟中，病毒于接種后36 h開始復制，72 h達到復制高峰；但在肝臟中，病毒于接種后60 h才開始復制，72 h達到復制高峰；而在腦組織中，病毒在接種之后一直持續(xù)低水平復制(圖2)。表明各內(nèi)臟器官中，Ca30株病毒在雞胚肺臟中的增殖量最多，其次為心臟、肝臟，但腦中僅呈一過性增殖。

表4 冷適應病毒對雞的免疫效力結(jié)果Table 4 Immune efficacy results of cold-adapted virus in chickens

圖1 免疫后SPF雞HI抗體測定結(jié)果Fig.1 The results of HI antibody titers post vaccination

2.5 Ca30株病毒感染SPF雞胚后的細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果 Ca30感染SPF雞胚，采集不同時間點雞胚肺臟，利用qPCR檢測肺臟中各類細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在肺臟組織中，IL-1β、IL-6、IL-12、IL-8和OAS的轉(zhuǎn)錄水平均在病毒接種72 h后達到峰值，分別上調(diào)8.27、7.8、7.9、16.47和4.35倍；MDA5在接種后48 h時轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)至峰值(4.18倍)，其中IL-12、OAS和MDA5的轉(zhuǎn)錄水平在組內(nèi)差異顯著(p＜0.05)(圖3)。表明Ca30能夠上調(diào)雞胚肺臟各類細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，激發(fā)細胞免疫的功能，降低了冷適應病毒對宿主肺臟組織的進一步傷害。

Ca30病毒接種SPF雞胚，采集不同時間點雞胚心臟，利用qPCR檢測心臟中各類細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在心臟組織中，IL-1β、IL-6、IL-12、IL-8、MDA5和OAS的轉(zhuǎn)錄水平均在病毒感染8 h有上調(diào)趨勢，其中IL-12、IL-8和MDA5的轉(zhuǎn)錄水平均在72 h再次上調(diào)(圖4)。表明病毒在接種之后迅速侵入雞胚心臟，引起各類免疫因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，繼而降低了病毒的增殖速度。

圖2 Ca30冷適應病毒接種SPF雞胚后不同時間點尿囊液和內(nèi)臟器官的病毒含量測定Fig.2 Ca30 cold-adapted virus contents at various time points after viral inoculation in SPF chickens embryos

圖3 Ca30病毒感染SPF雞胚肺臟中各細胞因子在不同時間點mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.3 Changes of mRNA transcription levels of various cytokines at different time points in lung of SPF chickens embryos infected with Ca30 virus

圖4 Ca30病毒感染SPF雞胚心臟中各細胞因子在不同時間點mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.4 Changes of mRNA transcription levels of various cytokines at different time points in heart of SPF chickens embryos infected with Ca30 virus

Ca30病毒接種SPF雞胚，采集不同時間點雞胚肝臟，利用qPCR檢測肝臟中各類細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，病毒感染肝臟72 h時IL-1β、IL-8和OAS的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)至峰值，分別上調(diào)4.28、5.25和4.81倍；IL-6在12 h和24 h下調(diào)，72 h則上調(diào)6.53倍；IL-12轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，60 h表達下調(diào)量最低15.06倍；MDA5轉(zhuǎn)錄水平變化不顯著(圖5)。結(jié)果表明，冷適應病毒感染SPF雞胚肝臟前期不能激發(fā)其的免疫應答，而感染后期則能夠引起部分免疫因子的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，這可能與感染前期肝臟中病毒復制量較少有關。

Ca30病毒接種SPF雞胚，采集不同時間點雞胚腦組織，利用qPCR檢測腦組織中各類細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，腦組織中各細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平變化均不明顯(圖6)，進一步證實前述實驗結(jié)果：冷適應病毒在SPF雞胚的腦組織中復制能力較低，所以激起的免疫應答也不足。

圖5 Ca 30病毒感染SPF雞胚肝臟中各細胞因子在不同時間點mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.5 Changes of mRNA transcription levels of various cytokines at different time points in liver of SPF chickens embryos infected with Ca30 virus

圖6 Ca30病毒感染SPF雞胚腦組織中各細胞因子在不同時間點mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.6 Changes of mRNA transcription levels of various cytokines at different time points in brain of SPF chickens embryos infected with Ca30 virus

3 討論

本研究制備的H9N2 AIV冷適應病毒株在25℃的復制能力與其母本病毒在33℃的復制能力相當，其在37℃已經(jīng)失去了復制能力，具有冷適應性和溫度敏感性，如果作為疫苗株使用，疫苗毒的擴增也必須在25℃條件下培養(yǎng)。本研究中冷適應株病毒Ca30在25℃?zhèn)鞔?0代次已獲得穩(wěn)定的氨基酸突變。動物實驗結(jié)果顯示，相比于母本CK/903/2013病毒，Ca30病毒排毒較少，病毒僅在喉氣管部低水平復制，雞的正常體溫在40.5～42℃，冷適應病毒無法復制，可能是上呼吸道與外界環(huán)境相通，溫度有所降低，冷適應病毒可能會少量復制。以上結(jié)果表明冷適應株病毒是有限復制，僅能在上呼吸道增殖，不能在下呼吸道增殖，對雞并無致病性，但可以誘導機體產(chǎn)生粘膜免疫和體液免疫。有研究表明，減毒活疫苗通過滴鼻免疫可以刺激黏膜免疫產(chǎn)生分泌型的sIgA，sIgA是外分泌液中的主要抗體類型，參與黏膜局部免疫，通過與流感病毒結(jié)合，阻止病毒黏附到細胞表面，從而在局部抗感染中發(fā)揮重要作用[7]。魏延迪等研究顯示，H9N2亞型AIV冷適應病毒株接種SPF雞后，僅在感染后2 d的氣管中檢測到病毒，與本研究結(jié)果一致，該研究對病毒在雞體內(nèi)的傳播能力進行了評價，發(fā)現(xiàn)冷適應病毒不會造成接觸性傳播[8]。血清HI抗體檢測顯示，Ca30病毒與同源和異源的H9N2毒株均有很好的交叉血凝抑制反應，具有良好的免疫原性。以上結(jié)果表明，Ca30病毒株可以作為H9N2 AIV冷適應疫苗候選株。

先天免疫是機體抵抗病毒侵入的第一道防線，病毒侵入后，首先被固有免疫細胞中的模式識別受體識別，進而激活先天性免疫細胞產(chǎn)生白介素等細胞因子，并誘導和調(diào)控宿主的適應性免疫應答[9]。然而，過度的先天性免疫反應往往加重疾病，例如季節(jié)性流感感染引發(fā)的肺部病理損傷[10]。所以能否引起宿主適度的先天性保護免疫反應是AIV弱毒疫苗研制的關鍵。本研究獲得的H9N2 AIV CK/903/2013株冷適應病毒Ca30感染雞胚后，在不同的器官中各類細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平變化呈現(xiàn)不同的趨勢。各內(nèi)臟器官中，病毒在肺臟中的增殖量最多，并能引起細胞免疫應答，表明流感病毒冷適應株對肺臟組織的親和力最強。在心臟中部分細胞因子在病毒感染初期轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，之后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)量降低甚至下調(diào)；而在心臟中，病毒感染36 h左右病毒開始復制，到72 h時復制達到高峰，卻未激發(fā)各類細胞因子的免疫應答，并且心臟中病毒的復制量明顯低于肺臟的復制量，說明感染初期各類細胞因子的轉(zhuǎn)錄抑制了心臟中病毒的復制速度，病毒量并不能造成機體的損傷。肝臟中各種細胞因子在多數(shù)時間點轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，而部分免疫因子的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)量在72 h達到峰值，并且病毒在肝臟中72 h時復制達到高峰，說明病毒初期可以在肝臟中低水平復制，但后期(60 h)病毒復制水平提高，引發(fā)部分細胞因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)；而在腦組織中，免疫反應很弱，可能與病毒在腦組織中低水平復制有關。

IL既具有致炎作用又有抗炎作用，是機體創(chuàng)傷和修復過程中一種重要的急性期反應介質(zhì)[11]。其中IL-12在機體免疫應答中尤其是在抗腫瘤免疫和抗病毒免疫中發(fā)揮極其重要的作用[12]。促炎因子IL-1β由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，刺激T細胞和B細胞增殖、觸發(fā)急性期反應和活化血管內(nèi)皮細胞等，促進炎癥反應，進而清除病毒和修復受損的組織[13-14]。本研究中，雞胚感染冷適應株病毒8 h后IL-1β即在其肺臟中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，感染后期再次轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，并且在病毒的復制高峰達到最大轉(zhuǎn)錄水平，證實IL-1β可能通過直接和間接的方式介導雞胚對流感病毒的免疫應答。IL-1β轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)進一步誘導炎性因子IL-6、IL-8等的釋放。IL-6在流感病毒感染過程中具有雙面作用，IL-6表達水平適當?shù)纳哂兄诓《镜那宄?，過度的IL-6釋放引起免疫病理損傷，IL-6是機體參與免疫應答調(diào)節(jié)和體現(xiàn)機體炎癥性疾病嚴重程度的指標之一[15-16]。IL-8具有抗感染、抗腫瘤以及免疫反應調(diào)節(jié)的作用，IL-8的表達水平可以作為炎癥疾病的診斷、鑒定依據(jù)之一[17]。本研究中，這些細胞因子在肺臟和肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平與病毒復制滴度密切相關，均在感染后72 h達到高峰。結(jié)果表明，冷適應病毒感染雞胚后，肺臟和肝臟中能夠表達一定量的促炎因子，促進機體清除病毒，這與機體保護性免疫有關，但IL-6和IL-8轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào)，說明冷適應株可能仍然會引起肺臟和肝臟的炎性反應。黑色素瘤分化相關基因5(MDA5)屬于RIG-I樣受體信號分子，在胞質(zhì)內(nèi)識別負鏈RNA病毒如AIV等，進一步通過MAVS激活IRF-3和NF-κB，引起宿主的抗病毒信號[18-19]。本研究制備的冷適應株激發(fā)宿主肺臟、心臟和肝臟的MDA5表達，并且在48 h達到表達高峰，說明該冷適應株可通過MDA5通路激發(fā)宿主的免疫保護效應。同時，MDA5和2'-5'寡聚腺苷合成酶(OAS)也是機體重要的抗病毒蛋白，在抗病毒過程中發(fā)揮重要作用[20]。研究表明，OAS在流感病毒侵入時，能夠增強宿主的抗病毒效應，具有良好的抗病毒活性[21]。在心臟中，冷適應病毒誘導MDA5表達量上調(diào)，MDA5在抗病毒感染中發(fā)揮重要作用，而在肺臟中，MDA5和OAS在抗病毒感染中發(fā)揮協(xié)同作用，促進病毒的清除。

綜上所述，制備的H9N2亞型AIV冷適應株對雞體具備免疫保護力。該病毒在37℃不復制，但能夠在25℃條件下，在雞胚肺臟、肝臟和心臟中復制，但并未激發(fā)強烈的宿主免疫應答，這應該與冷適應株的保護性有關。本研究從先天性免疫角度初步闡明冷適應弱毒疫苗的免疫應答機制。