馬美哥，于蒙蒙，許傳田，黃慶華，孟照潔，王素艷，邢立曉，常方方，劉長軍，祁小樂，王永強，孫延鳴，王笑梅*，高玉龍*

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽免疫抑制病創(chuàng)新團隊，黑龍江哈爾濱150069；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南250100；4.山東和康源生物育種股份有限公司，山東濟南271018)

禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的禽類多種惡性或良性腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，以成年雞淋巴樣腫瘤和產(chǎn)蛋量下降為主要特征。ALV是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，根據(jù)病毒囊膜干擾性、宿主范圍和病毒交叉中和反應(yīng)，ALV可分為11個亞群，分別命名為ALV-A～J[1]和近幾年分離到的K亞群[2]。其中A、B、C、D、J、K亞群的ALV屬于外源性ALV[2]，E亞群為內(nèi)源性ALV[3]。ALV為反轉(zhuǎn)錄病毒科的α反轉(zhuǎn)錄病毒屬，其前病毒基因組具有典型的C型反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)特征，即5'LTR-5'UTR-gag-pol-env-3'UTR-3'LTR。包含3個主要編碼基因gag、pol和env。env基因編碼囊膜表面蛋白gp85和穿膜蛋白gp37。gp85蛋白含有病毒受體決定簇，其對病毒抗原性以及病毒侵入宿主細胞具有重要作用，決定亞群特異性和宿主范圍[4]。前病毒兩末端結(jié)構(gòu)完全相同的U3-R-U5長末端重復(fù)序列(LTR)在ALV的復(fù)制中至關(guān)重要，其與細胞DNA連接，有啟動子和增強子活性，與病毒RNA的復(fù)制和翻譯有關(guān)，其中U3區(qū)有多種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，在病毒的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)控作用，并在病毒復(fù)制傳播過程中容易發(fā)生變異[5]。另外，3'端非編碼區(qū)(3'UTR)不編碼蛋白質(zhì)，但其中的元件：env基因下游的rTM(redundant TM)、單拷貝正向重復(fù)單位DR(Direct repeat)和E元件(E element)在ALV病毒粒子的裝配、致瘤性方面均起著重要作用[6]。

J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(Subgroup J Avian Leukosis Virus，ALV-J)引起的以髓細胞瘤和其它細胞惡性腫瘤為特征的腫瘤性傳染性疾病，是近年來一種致病性更強和傳播能力更快的外源性ALV，主要引起肉用型雞發(fā)生骨髓細胞瘤[7]。2018年以來，遼寧、山東等地某品種進口白羽肉種雞發(fā)生了嚴(yán)重的禽白血病，主要發(fā)生在17～19周的父母代肉種雞，引起嚴(yán)重的腫瘤疾病，損失非常嚴(yán)重，本團隊前期研究確診了引起進口白羽肉種雞發(fā)生禽白血病的病原為ALV-J[8]。為進一步研究引起這次疫情的病毒來源及其變異趨勢，本研究對從發(fā)病進口白羽肉種雞分離的8株ALV-J進行了全基因組克隆測序分析，以期對ALV-J變異趨勢提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒株及主要試劑 8株病毒均分離自2018年5月～7月山東、遼寧等發(fā)病白羽肉雞腎、肝、脾等臟器，均為 ALV-J[8]，分別命名為 SD1801、SD1802、 SD1804、 SD1805、 SD1806、 SD1807、SD1808及SD1809。DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞由本實驗室制備保存。ExTaq酶、pMD18-T載體、DL2000 DNA Marker等均購自TaKaRa公司；DNA提取及膠回收試劑盒均購自AXYGEN公司。

1.2 8株ALV-J病毒株的全基因組擴增及測序以GenBank登錄的ALV-J原型病毒株(HPRS-103，Z46390)為參考株，設(shè)計6對全長擴增引物(表1)。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

表1 前病毒全基因組DNA擴增的引物序列Table 1 Primers used to amplify the proviral full genomic DNA

取200 μL各病毒培養(yǎng)液，利用DNA提取試劑盒提取各病毒株的DNA，并以其為模板，應(yīng)用上述設(shè)計的特異性引物通過PCR方法分別擴增8株ALV-J病毒株的6個基因片段。反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 2 min 30 s，30個循環(huán)；72℃10 min。6個基因片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，并將其克隆于pMD18-T載體中，選取每個基因片段的3～5個陽性克隆送吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.3 8株ALV-J病毒株全基因組序列分析 利用DNAStar中的SeqMan軟件對各病毒株6個基因片段的測序結(jié)果進行剪輯、拼接。利用MegAlign對拼接的全基因組序列與GenBank中登錄的18個ALV-J肉雞分離株(包括HPRS-103、美國肉雞分離株、國內(nèi)肉雞)及16個蛋雞分離株序列進行核苷酸及gp85蛋白氨基酸的同源性分析。利用MEGA6.0軟件中的minimum-evolution方法繪制gp85蛋白氨基酸及U3區(qū)基因序列系統(tǒng)進化樹譜。利用Soft Berry軟件分析U3區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。

2 結(jié)果與討論

2.1 8株ALV-J病毒株全基因組序列測定與分析以提取的各病毒分離株基因組DNA為模板，利用設(shè)計的6對全基因組DNA擴增引物，進行分段擴增及測序，利用DNAStar中SeqMan軟件對6個片段的測序結(jié)果進行剪輯和拼接，得到了8株ALV-J病毒株全基因組的核苷酸序列。8株ALV-J基因組全長7 447 bp～7 452 bp。3個主要結(jié)構(gòu)基因gag、pol、env長度分別為2 106 bp、2 622 bp和1 521 bp，分別編碼701、873和506個氨基酸，與HPRS-103的各段結(jié)構(gòu)基因大小完全一致；3'UTR主要包括rTM、DR-1和E元件，長度為375 bp；3'LTR長度為314 bp。將8株ALV-J與肉雞分離株(HPRS-103、美國肉雞分離株和國內(nèi)肉雞分離株)及國內(nèi)蛋雞分離株進行了同源性分析。結(jié)果表明，gag、pol、gp37基因相對保守，與參考株的同源性為95%～96.7%；而分離株gp85、3'UTR、U3區(qū)基因差異較大。

2.2 8株ALV-J病毒株與其它參考株gp85氨基酸序列的比較分析 位于病毒粒子表面的gp85蛋白在ALV的進化中發(fā)揮著重要的作用，其與病毒的抗原性、組織親嗜性以及毒力密切相關(guān)，是ALV致腫瘤的關(guān)鍵蛋白[4]。gp85蛋白氨基酸的多重變異決定了ALV病毒株的變異，其變異主要集中于hr1、hr2及可變區(qū)3(vr3)，已有研究證實hr1、hr2對受體結(jié)合起主要作用，其突變更有利于病毒逃避宿主免疫監(jiān)視，更好的適應(yīng)環(huán)境壓力[9]。本研究利用MegAlign對已得到的8株ALV-J病毒株的gp85氨基酸序列與ALV-J參考株進行序列分析比較，結(jié)果顯示，8株ALV-J病毒株的gp85基因，長度為918bp～924bp，分別編碼306～308個氨基酸。8株ALV-J gp85氨基酸序列之間同源性為95.8%～100%；其與肉雞分離株的氨基酸同源性均低于92.2%。而與2014年父母代白羽肉種雞分離株GD14J2的同源性較高，為93.5%～95.1%。遺傳進化樹分析結(jié)果顯示，8株ALV-J的gp85氨基酸與GD14J2病毒株處于同一分支(圖1)。

與肉雞分離株及國內(nèi)蛋雞分離株相比，8株ALV-J gp85編碼的氨基酸區(qū)段有14個氨基酸位點發(fā)生一致性突變，即：5M、54N、61N、65E、75R、79A、115S、118T、119缺失、175G/S、176G、189G、200G、297M，其中高變區(qū)1(hr1)有2個氨基酸(115S、118T)突變及1個氨基酸(119位)缺失，hr2有2個氨基酸(189G、200G)突變。其中有6個氨基酸(6/14)：5M、51N、65E、190G、200G、297M的突變和GD14J2相同。以上結(jié)果表明可能在免疫選擇等環(huán)境壓力作用下，該病毒已出現(xiàn)新的變異，但這些氨基酸變異與病毒致病性及毒力的改變是否有關(guān)，還有待進一步研究。

2.3 8株ALV-J病毒株與其它參考株3'UTR基因序列的比較 3'UTR在病毒粒子組裝和誘導(dǎo)腫瘤形成中起著關(guān)鍵作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，我國早期肉雞ALV-J分離株一般保留有rTM，而蛋雞ALV-J rTM區(qū)出現(xiàn)了175 bp的缺失，近年來在大量ALV-J病毒株中均發(fā)現(xiàn)rTM的缺失[10]，本研究8株ALV-J的rTM區(qū)出現(xiàn)了203 bp的缺失，表明rTM的缺失不影響病毒的復(fù)制與傳播，但可能與該病毒的進化和毒力有關(guān)，其作用不容忽視。DR-1存在于所有ALV-J分離株的3'UTR中，先前研究表明DR-1作為一個結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)運元件，其在病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用，它的缺失或突變會降低ALV的感染效率[11]。早期蛋雞ALV-J DR-1存在30 bp缺失[12]，本研究中8株ALV-J病毒株的3'UTR包括env基因下游的rTM、DR-1和E元件，其與肉雞分離株及國內(nèi)蛋雞分離株的同源性僅為64.4%～87.4%，而與2014年父母代白羽肉種雞ALV-J分離株GD14J2的同源性最高，為99.4%。與HPRS-103相比，3'UTR的rTM缺失203 bp，DR-1區(qū)缺失7 bp；同時E元件缺失125 bp，僅保留了22個堿基(圖2)。暗示E元件高度保守的20 bp～22 bp核苷酸序列可能對病毒復(fù)制是必需的，其與病毒導(dǎo)致嚴(yán)重腫瘤的相關(guān)性還需進一步研究。以上8株ALV-J在3'UTR區(qū)的變異均與2014年父母代白羽肉雞分離株GD14J2 3'UTR區(qū)的變異相似，表明它們在3'UTR區(qū)有類似的進化。

圖1 本研究新分離ALV-J病毒株gp85氨基酸進化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of gp85 amino acid Sequences of the new ALV-J isolates and reference strains

圖2 ALV-J分離株3'UTR核酸序列比較Fig.2 Comparison of the nucleotide deletions in the 3'UTR of ALV-J isolates

2.4 8株ALV-J病毒株與其它參考株3'LTR基因序列的分析 LTR由U3、R、U5組成，作為反轉(zhuǎn)錄病毒的一種強轉(zhuǎn)錄調(diào)控單元，LTR U3區(qū)含有高度保守的轉(zhuǎn)錄啟動子和增強子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，能夠驅(qū)動禽類許多細胞中病毒基因的轉(zhuǎn)錄[5]。本研究結(jié)果顯示8株ALV-J的3'LTR之間關(guān)系密切，基因同源性為98.6%～100%。其中U5和R區(qū)高度保守，與其它參考株的同源性為95.2%～96.8%。U3區(qū)與肉雞分離株及國內(nèi)蛋雞分離株同源性均低于91.5%，而與2014年父母代白羽肉雞分離株GD14J2的親緣關(guān)系較近，同源性為94.3%～96.3%，處于同一分支(圖3)。U3區(qū)有7個堿基：19T、111A、115C、137T、151A、155G、164T出現(xiàn)一致性突變，其中3個堿基：137T、155G、164T的突變與GD14J2一致。利用Soft Berry軟件對8株ALV-J的U3區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，其包含多個較為保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，均含有2個CArG box和Y box，符合典型復(fù)制能力較強的外源性ALV的特點。另外發(fā)現(xiàn)，164位堿基突變(C/T)形成1個新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件AIB REP2，112～122位出現(xiàn)連續(xù)11 bp堿基缺失形成另一個新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件AIB REP1。這些缺失和突變有可能造成LTR啟動基因轉(zhuǎn)錄活性的改變，進而影響ALV的毒力和致瘤性。

綜上所述，8株白羽肉種雞ALV-J分離株的gp85、3'UTR、U3區(qū)基因與肉雞分離株(包括ALV-J原型株HPRS-103、美國肉雞分離株和國內(nèi)肉雞分離株)及國內(nèi)蛋雞分離株同源性較低，而與國內(nèi)2014年父母代白羽肉種雞ALV-J分離株GD14J2親緣關(guān)系較近，屬于同一遺傳分支。因而推測，引起本次進口白羽肉種雞禽白血病的ALV-J可能與GD14J2分離株為同一來源，盡管對該分離株的來源未見報道，但目前國內(nèi)的白羽祖代肉種雞主要依賴進口，故推測本研究白羽肉種雞ALV-J可能由進口國外白羽祖代肉種雞引入，該分離株的致病性及對我國已凈化肉種雞、蛋種雞和本地雞群的影響正在評估中。本研究在分析父母代白羽肉種雞ALV-J分子特征的基礎(chǔ)上，探究了這次疫情的病毒株來源及其變異趨勢，為該病的有效防控和凈化提供參考依據(jù)，同時警示，將禽白血病等種源性疾病納入到進口祖代雞必檢項目勢在必行，以防止疫病隨進口動物傳入我國，影響我國動物安全生產(chǎn)。

圖3 本研究新分離ALV-J病毒株U3區(qū)基因序列遺傳進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of the U3 region of new ALV-J isolates sequenced in present study