左智敏，康洪濤，吳紅霞，祖少坡，田 進，劉永相，倪宏波，曲連東*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江大慶163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150069)

貓杯狀病毒病(Feline caliciviral disease，F(xiàn)CVD)又稱貓傳染性鼻結(jié)膜炎，是一種由貓杯狀病毒(Feline calicivirus，F(xiàn)CV)感染引起的貓科動物口腔和上呼吸道感染的高發(fā)傳染病。該病在臨床上主要表現(xiàn)為鼻炎、結(jié)膜炎和口腔潰瘍，有時可以導致支氣管炎、肺炎及慢性口腔潰瘍，個別會出現(xiàn)關(guān)節(jié)或肌肉疼痛[1-2]，是嚴重危害寵物、經(jīng)濟動物和野生動物健康的重要疫病。

FCV F9株于上世紀50年代被分離[3]，是FCV的原始疫苗株，也是大多數(shù)FCV活疫苗的親本株，被普遍用于FCV疫苗方面的研究[4]。最近Afonso等[5]對歐洲多國的FCV流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，目前FCV F9株仍然能夠誘導機體產(chǎn)生具有廣譜中和效應的抗體[5]，F(xiàn)CV F9株應當作為歐洲地區(qū)FCV疫苗接種的首選。本研究采用分段克隆的方法，將FCV F9株的全基因組分3段擴增并依次克隆至pOK-12載體中，經(jīng)序列替換，獲得嵌合FCV F9株的全基因組克隆，并拯救出病毒。本研究首次構(gòu)建出嵌合FCV F9株的感染性克隆，以期為FCV新型疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為FCV致病機理和免疫機制的研究提供技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 FCV F9株、pOK-12載體、已構(gòu)建出的嵌合FCV強毒株的感染性克隆質(zhì)粒pOK-2280[6]和貓腎細胞(F81)由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所自然疫源性人獸共患病團隊保存并提供。病毒RNA/DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒以及膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；限制性內(nèi)切酶、CloneJET試劑盒、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTMMessengerMAXTMTransfection Reagent購自Thermo公司；DNA Marker、體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 HiScribeTMT7以及 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase試劑盒購自NEB公司；Ribom 7G Cap Analog試劑盒購自Promega公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)FCV F9株基因序列(AB643784.1)設(shè)計相關(guān)的引物(表1)，并由吉林庫美生物科技有限公司合成。

1.3 pOK-12載體的改造 將人工合成的含XhoⅠ-KpnⅠ-SacⅠ-SalⅠ-PstⅠ-NotⅠ的寡核苷酸 pOK-linker-F與pOK-linker-R等摩爾比混合，通過94℃變性10 min，55℃復性20 min，獲得具有粘性末端的雙鏈DNA。將雙鏈DNA純化后與經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ酶切的pOK-12質(zhì)粒連接，獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確后命名為pOK-LK。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

1.4 嵌合FCV F9株全長基因組重組質(zhì)粒的構(gòu)建按照試劑盒的使用說明提取FCV F9的病毒基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以該cDNA為模板進行下述PCR擴增。

以引物T7F9-F/F9-R1 PCR擴增F9-T7G1片段，經(jīng)純化后用CloneJET試劑盒連接到pJET1.2中，獲得 pJET-F9-T7G1。SalⅠ和 SacⅠ酶切 pJET-F9-T7G1獲得F9-T7G1片段并克隆到pOK-LK中，獲得pOKF9-T7G1。

以引物F9-F2/F9-R2擴增F9G2片段，經(jīng)純化后連接到pJET1.2中，獲得pJET-F9G2，SacⅠ和PstⅠ酶切pJET-F9G2，回收F9G2片段，插入到pOK-F9-T7G1中，獲得pOK-F9-T7G1G2。

將文獻[6]中引物 Hdr1-F、Hdr2-R、Hdr3-F、Hdr4-R等摩爾比混合，94℃變性10 min、55℃復性20 min，獲得產(chǎn)物HDRZ。以引物F9-F3/F9-R3擴增F9G3片段。以F9G3和HDRZ為模板，通過引物F9-F3/Hdr4-R擴增F9G3-HDRZ片段，純化后連接至pJET1.2中，獲得pJET-F9G3-HDRZ。將其經(jīng)PstⅠ和NotⅠ酶切后克隆到pOK-F9-T7G1G2中，獲得pOK-F9-F，并對質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定。

1.5 嵌合FCV全長基因組感染性克隆pOK-F9H的構(gòu)建與鑒定 為將pOK-F9-F的1823位前段區(qū)域(1685～1940)替換為pOK-2280相應區(qū)域，進行了下列操作：分別以質(zhì)粒pOK-F9-F和pOK-2280為模板，以引物Hid-F/1685-R和1685f/28sacR PCR擴增2280-F9A片段(1 115～1 684)和2280-F9B片段(1 685～1 940)，并以Hid-F/28sacR為引物，對2280-F9A片段和2280-F9B片段進行融合PCR擴增，獲得2280-F9的融合片段(1 115～1 940)。

將2280-F9片段中出現(xiàn)差異的5個氨基酸位點突變成FCV F9對應的氨基酸。以2280-F9為模板，引物2280-F9-F1/2280-F9-R1 PCR擴增產(chǎn)物A；以2280-F9為模板，以引物2280-F9-F4/2280-F9-R4 PCR擴增產(chǎn)物K；以產(chǎn)物A和K為模板，以引物2280-F9-F1/2280-F9-R4 PCR擴增產(chǎn)物B；以2280-F9為模板，引物2280-F9-F2/2280-F9-R3 PCR擴增產(chǎn)物C；以2280-F9為模板，以引物2280-F9-F3/1820r PCR擴增產(chǎn)物D；以產(chǎn)物C和D為模板，以引物2280-F9-F2/1820-R PCR擴增產(chǎn)物F；以產(chǎn)物B和F為模板，引物2280-F9-F1/1820-R PCR擴增產(chǎn)物H1；以2280-F9為模板，以引物1820F/F9-R1 PCR擴增產(chǎn)物H2；以產(chǎn)物H1和H2為模板，以引物2280-F9-F1/F9-R1 PCR擴增產(chǎn)物2280-F9H；2280-F9H片段的氨基酸序列與FCV F9完全相同。以HindⅢ和SacⅠ酶切2280-F9H替換pOK-F9-F相應序列，最終得到嵌合質(zhì)粒 pOK-F9H。經(jīng) SalⅠ和 NotⅠ雙酶切鑒定pOK-F9H質(zhì)粒，并對質(zhì)粒全長測序鑒定。

1.6 嵌合病毒rFCV F9的拯救 將重組質(zhì)粒pOK-F9H以NotⅠ酶切線性化，體外轉(zhuǎn)錄、RNA加帽和回收后，根據(jù)文獻[7]方法轉(zhuǎn)染F81細胞中進行病毒拯救。將轉(zhuǎn)染后制備的病毒液接種新的F81細胞，當細胞出現(xiàn)50%CPE時，收取上清液，命名為rFCV F9的P1代病毒。連續(xù)傳代至P10代，根據(jù)試劑盒的使用說明提取rFCV F9 P10代病毒與親本病毒的基因組，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以引物F9-F1/F9-R1擴增FCV F9-G1片段和rFCV F9-G1片段并對PCR產(chǎn)物測序鑒定。

1.7 嵌合rFCV F9的蝕斑和細胞病變(CPE)形成試驗 將拯救病毒與親本病毒分別按照MOI 0.01分別接種于密度為100%的六孔板中的F81細胞中。病毒吸附1 h后棄掉病毒液，無血清DMEM沖洗兩遍，將2%的低熔點瓊脂糖與2×DMEM混合后以3 mL/孔鋪于六孔板，置于37℃培養(yǎng)36 h后，用4%甲醇固定細胞2 h，結(jié)晶紫染色15 min，觀察兩種病毒蝕斑的大小及形態(tài)。

同時，將拯救病毒與親本病毒分別按照MOI 0.001感染處于對數(shù)生長期的24孔板中的F81細胞。經(jīng)上述步驟處理后，置37℃培養(yǎng)36 h后在顯微鏡下觀察兩種病毒CPE的形成情況。

1.8 嵌合rFCV F9多步生長曲線的測定 將拯救病毒與親本病毒按照MOI 0.001分別感染處于對數(shù)生長期的24孔板中的F81細胞，分別在感染后的12 h、24 h、36 h和48 h收獲病毒，采用文獻[6]中方法測定收獲病毒的病毒滴度，每個時間點重復測定3次，繪制病毒的多步生長曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 pOK-12載體的改造結(jié)果 將具有粘性末端的雙鏈DNA純化后與經(jīng) XhoⅠ和 NotⅠ酶切的pOK-12質(zhì)粒連接，測序結(jié)果顯示，獲得了插入酶切位點的重組質(zhì)粒pOK-LK。

2.2 FCV F9株全基因組的拼接 以FCV F9的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增獲得的F9-T7G1、F9G2、F9G3-HDRZ片段大小分別為2.8 kb、2.8 kb、2 kb(圖1)，依次插入到改造后的載體pOK-LK中，重組質(zhì)粒命名為pOK-F9-F。測序結(jié)果顯示，質(zhì)粒pOK-F9-F的1823位堿基出現(xiàn)移碼突變，其余基因序列與親本病毒完全相同。

2.3 嵌合FCV全長基因組感染性克隆的構(gòu)建 經(jīng)測序pOK-F9-F第1823位基因出現(xiàn)移碼突變，所以將pOK-F9-F的1823位前段替換為pOK-2280相應區(qū)域。分別以質(zhì)粒pOK-F9-F和pOK-2280為模板，分別經(jīng)PCR擴增出2280-F9A片段和2280-F9B片段并融合，獲得2280-F9融合片段。將2280-F9片段中與FCV F9存在差異的5個氨基酸位點依次突變?yōu)镕CV F9的氨基酸，獲得2280-F9H片段。將2280-F9H片段通過HindⅢ和SacⅠ雙酶切替換至質(zhì)粒pOK-F9-F中的相應部分，獲得嵌合無突變的FCV F9全基因組序列的質(zhì)粒pOK-F9H。經(jīng)SalⅠ和NotⅠ雙酶切pOK-F9H(載體2.1 kb，插入片段8 kb)，鑒定，結(jié)果與預期相符(圖1)，測序結(jié)果無突變。表明構(gòu)建了嵌合FCV F9株全基因組序列的重組質(zhì)粒。

本研究中構(gòu)建的pOK-F9-F質(zhì)粒第1823位基因增加了一個堿基T，產(chǎn)生移碼突變。盡管嘗試了多種方式重新構(gòu)建，但該突變?nèi)匀淮嬖?。為?gòu)建出FCV F9感染性克隆，本研究將pOK-F9-F的1685～1940位基因序列替換為pOK-2280[6]的相應序列，并將前者基因組推導的氨基酸差異位點依次突變?yōu)镕9株相應位置的同義密碼子。替換后獲得具有同義密碼子的嵌合FCV F9全基因組的重組質(zhì)粒pOK-F9H。

圖1 目的片段的擴增及重組質(zhì)粒pOK-F9H的雙酶切鑒定Fig.1 Amplification of target genes and identification of recombinant plasmid pOK-F9H using double enzyme digestion

2.4 嵌合rFCV F9病毒的拯救 將體外轉(zhuǎn)錄制備的pOK-F9H的加帽RNA轉(zhuǎn)染F81細胞，24 h后出現(xiàn)典型的CPE，未轉(zhuǎn)染細胞無變化。將轉(zhuǎn)染后制備的病毒液接種新的F81細胞，當細胞出現(xiàn)50%CPE時，收獲上清液(P1代)，將P1代病毒連續(xù)傳至P10代后仍然有CPE產(chǎn)生，表明獲得了可以穩(wěn)定傳代的病毒。

進一步對親本病毒和獲得的P10代拯救病毒分別進行PCR擴增，分別獲得FCV F9-G1片段和rFCV F9-G1片段。測序結(jié)果顯示該兩個片斷雖然堿基序列存在差異，但推導出的氨基酸序列相同。

2.5 嵌合rFCV F9的蝕斑和CPE形成試驗結(jié)果接種F81細胞后，拯救病毒和親本病毒均可以產(chǎn)生明顯蝕斑，且形成的蝕斑大小和形態(tài)基本一致(圖2)；兩株病毒感染F81細胞后產(chǎn)生的CPE基本一致(圖2)。以上結(jié)果表明拯救病毒與親本病毒具有相似的噬斑形成能力和相似的CPE形成能力。

2.6 嵌合rFCV F9的多步生長曲線測定 繪制的病毒多步生長曲線結(jié)果顯示，rFCV F9和FCV F9的體外多步生長生長曲線基本一致(圖3)，表明rFCV F9與FCV F9具有相似的體外生長能力。推測，F(xiàn)CV的生物學特性可能僅由氨基酸序列決定，堿基序列不對病毒生物學特性產(chǎn)生影響；pOK-F9轉(zhuǎn)化到細菌中后影響了細菌的增殖，推測FCV F9的堿基序列在細菌增殖時可能發(fā)揮某些未知的阻礙作用。

后續(xù)將會探究FCV基因組各蛋白的生物學特性，了解病毒蛋白在其生命活動周期中發(fā)揮的功能，為FCV基因的功能提供新的理解。

圖2 拯救病毒和親本病毒感染F81細胞后形成的蝕斑和CPEFig.2 Plaques and CPE compare F81 cells infected with virus after 36 h

圖3 rFCV F9和親本株FCV F9的多步生長曲線Fig.3 Multi-step growth curve of rFCV F9 and FCV F9