田 浪，溫貴蘭*，張升波，楊佰啟，李昌紅，徐 麗，陳 廣，張喜懿，龔新勇，陳彥希，文 明

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；2.貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽550016)

目前我國養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)形成較大的規(guī)模，但由于高密度的養(yǎng)殖、環(huán)境的惡化和抗生素的濫用等因素，豬感染的病毒病也越來越多。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒引起的豬一種繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)高度接觸性傳染病，被認(rèn)為是影響?zhàn)B豬業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一，目前尚無特效藥治療PRRS，因此研制高效、經(jīng)濟(jì)、安全的抗PRRSV新型藥物制劑顯得非常重要。

干擾素(Interferon，IFN)是在特定的誘生劑作用下，由細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有高度生物學(xué)活性的糖蛋白，具有廣譜抗病毒活性[1]。IFN本身并非直接抗病毒物質(zhì)，不直接與靶分子作用，而首先要與靶細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合，通過信號(hào)傳遞，引發(fā)一系列特定的生化反應(yīng)，刺激細(xì)胞內(nèi)多種效應(yīng)蛋白質(zhì)分子合成，從而發(fā)揮IFN的活性功能[2]。豬IFN-α、豬IFN-β屬于IFN-I，具有重要的抗病毒生物學(xué)活性。已有研究人員在畢赤酵母或桿狀病毒中表達(dá)了豬IFN-α，表達(dá)蛋白對(duì)PRRSV、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒2型具有抑制作用[3-5]；在畢赤酵母表達(dá)了豬IFN-β，表達(dá)蛋白對(duì)偽狂犬病毒、PRRSV、水泡性口炎病毒具有抑制作用[6-8]。

從江香豬主產(chǎn)于貴州省從江縣，屬于中國稀有微型的地方優(yōu)良品種豬，其具有基因純合、近交不退化、適應(yīng)性強(qiáng)和抗病力強(qiáng)等優(yōu)良特點(diǎn)，是豬相關(guān)疾病研究的理想動(dòng)物模型，有著較高的研究價(jià)值[9]。溫貴蘭等報(bào)道從江香豬源IFN-α2核苷酸序列與豬源IFN-α2核苷酸序列同源性為98.7%，同時(shí)存在7處堿基的變異，前者推導(dǎo)的氨基酸序列與后者存在4處差異；從江香豬IFN-β基因核苷酸序列與其它豬源IFN-β基因同源性為99.5%～100%，其氨基酸序列與巴馬豬、梅山豬IFN-β的氨基酸序列同源性均為100%，但與貴州白香豬IFN-β的氨基酸序列同源性為99.5%，存在E43Q、K73R和C16R 3處氨基酸差異[10-11]。到目前為止，尚未見融合從江香豬源IFN-α2、IFN-β于生菜中瞬時(shí)表達(dá)并對(duì)瞬時(shí)表達(dá)蛋白進(jìn)行抗病毒活性研究的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含從江香豬源 IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β 的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，采用根癌農(nóng)桿菌滲透法感染生菜，對(duì)瞬時(shí)表達(dá)的從江香豬源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β 蛋白進(jìn)行抗 PRRSV 活性研究，以期為從江香豬源IFN抗PRRSV新復(fù)合型藥物的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 含從江香豬源IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β的質(zhì)粒pUCm-CJpoIFN-α2、pUCm-CJpoIFN-β、pUCm-CJpoIFN-α2β 以 及 PRRSV GZBJ201712 株 、Marc 145細(xì)胞、PK15細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；新鮮生菜購自貴州省花溪區(qū)某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞購自上海維地生物技術(shù)有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、TRIzol試劑、SmaⅠ、XbaⅠ、DL2000 DNA Marker、SYBR Premix ExTaqⅡ、HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒、β-葡萄糖苷酶(GUS)染液試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；λ DNA/HindⅢ購自天根生化科技有限公司；乙酰丁香酮、2-(N-嗎啡啉)乙磺胺(MES)均購自北京索萊寶科技有限公司；豬IFN-α ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；豬IFN-β ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、2×EsTaqDNA聚合酶購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；植物雙元表達(dá)載體pBI121購自上海繼和生物科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank登錄的豬IFN-α2 基因序列(NM_001130219)、IFN-β 基因序列(GQ415073)、PRRSV全基因組序列(EF112445)、β-actin基因序列(NM_001199954)，利用軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增 IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β、N 基因、β-actin 的引物序列(表1)。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。下劃線為酶切位點(diǎn)。

表1 本研究所用引物Table 1 The sequences of the primers used in this study

1.3 含從江香豬源各干擾素植物表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 采用設(shè)計(jì)擴(kuò)增各基因的引物，分別以pUCm-CJpoIFN-α2、pUCm-CJpoIFN-β、pUCm-CJpoIFN-α2β質(zhì)粒為模板對(duì) IFN-α2、IFN-β、 IFN-α2β 基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件：94℃2 min；94℃30 s、55℃30 s、72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收純化。經(jīng)SmaⅠ和XbaⅠ雙酶切后連接至經(jīng)相同雙酶切的植物表達(dá)載體pBI121中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBI121-IFN-α2、pBI121-IFN-β、pBI121-IFN-α2β。將各質(zhì)粒包括空質(zhì)粒pBI121-Vec分別轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，菌液PCR篩選陽性重組菌。對(duì)陽性重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取各質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切鑒定后由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序鑒定。

1.4 從江香豬源干擾素浸染液的制備 取含pBI121-IFN-α2、 pBI121-IFN-β、 pBI121-IFN-α2β、pBI121-Vec質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌液，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.8時(shí)轉(zhuǎn)移至的10 mL離心管中，4 000 r/min室溫離心5 min，分別收集各菌體沉淀，利用液體MS培養(yǎng)基重懸至原體積，加入2 mL 50 mmol/L乙酰丁香酮及10 mL 0.5 mol/L MES，使其終濃度分別為200 μmol/L和10 mmol/L，即為浸染液。

1.5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)從江香豬源干擾素的真空滲透瞬時(shí)表達(dá) 新鮮生菜去除損傷葉片，用自來水漂洗2～3次，再用無菌水漂洗2～3次后超凈工作臺(tái)內(nèi)風(fēng)干，將用無菌針頭刮傷的葉片放入1.4制備的浸染液中，在0.08 mbar氣壓下連續(xù)抽真空40 min，關(guān)掉真空泵，快速排氣。取出浸染好的刮傷生菜葉片用無菌水漂洗2～3次，濾干后放入鋪有無菌吸水紙的培養(yǎng)皿中，置于植物光照培養(yǎng)箱中，在22℃每天光照16 h，光照強(qiáng)度為2000 lx。培養(yǎng)48 h收取生菜葉用于后續(xù)試驗(yàn)或-20℃保存。

1.6 從江香豬源干擾素在生菜中瞬時(shí)表達(dá)的檢測(cè)用剪刀在1.5收獲的生菜葉片上隨機(jī)剪1 cm×1 cm大小的葉片3片。將剪好的葉片置于1.5 mL離心管的無菌水中洗滌，用濾紙吸干葉片表面水分。按GUS染色液試劑盒說明書染色后肉眼觀察顯藍(lán)色的植株后挑取完整的葉片放入載玻片中，滴一滴蒸餾水，400倍顯微鏡下觀察并照相，檢測(cè)各干擾素的表達(dá)情況。

分別稱取真空侵染的生菜葉片4 g置于研缽中，加入液氮研磨后按每0.1g葉片加入150 μL蛋白提取 緩 沖 液 (NaCl， 8.9 g； KCl， 0.2 g； Na2HPO4，1.44 g，KH2PO4，0.24 g；ddH2O 定容至 1 000 mL，4℃保存)，冰浴研磨。每隔10 min研磨一次，30 min后，4℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清液即為蛋白液。按照豬IFN-α、豬IFN-β ELISA試劑盒說明分別檢測(cè)從江香豬源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中的表達(dá)。

1.7 生菜中瞬時(shí)表達(dá)的從江香豬干擾素蛋白對(duì)PRRSV抑制作用的檢測(cè) 將1.6提取的各蛋白液利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定其濃度后，分別用濾菌器過濾并稀釋至1.5 mg/mL。設(shè)置6個(gè)組：IFN-α2+PRRSV； IFN-β+PRRSV； IFN-α2β+PRRSV；IFN-α2+IFN-β+PRRSV，PRRSV 陽性對(duì)照；VEC(空載體)+PRRSV作為對(duì)照組。向長滿Marc145細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔分別加入各蛋白液150 μL(蛋白終濃度為0.75 mg/mL)，37℃5%CO2培養(yǎng)24 h，棄掉蛋白液后各孔加入300 TCID50的PRRSV病毒液，37℃ 5%CO2培養(yǎng)60 min，吸出病毒液，每孔加入 500 μL含 5%FBS的 DMEM，37℃ 5%CO2培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞。TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)Marc145細(xì)胞中PRRSV N基因的拷貝數(shù)[12]。采用相對(duì)比較 Ct法(Qr=2-ΔΔCt)分析數(shù)據(jù)，采用Graphpad_Prism_6.04軟件繪制差異圖。

向長滿Marc145細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中依次加入100 μL 4倍倍比稀釋(41～410的生菜中表達(dá)的各從江香豬源的IFN)，每個(gè)樣設(shè)3個(gè)重復(fù)。設(shè)置5個(gè) 組 ： IFN-α2+PRRSV； IFN-β+PRRSV； IFN-α2β+PRRSV；PRRSV；VEC+PRRSV。以VEC+PRRSV為對(duì)照組。37℃5%CO2培養(yǎng)24 h，棄掉蛋白液后各孔加入100 TCID50的PRRSV病毒液，37℃5%CO2培養(yǎng)60 min，吸出病毒液，每孔加入100 μL含5%FBS的DMEM，37℃5%CO2培養(yǎng)72 h后觀察各IFN抑制Marc145細(xì)胞病變(CPE)的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 含從江香豬源各IFN植物表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 采用1.3設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增從江香豬源各IFN基因，結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得的目的條帶分別約為540 bp、560 bp、1 100 bp，均與預(yù)期結(jié)果一致(圖1A)。

利用 PCR 擴(kuò)增獲得的 IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pBI121-IFN-α2、pBI121-IFN-β、pBI121-IFN-α2β。PCR 鑒定各重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示擴(kuò)增的各目的條帶均與預(yù)期結(jié)果一致(圖1B)。各重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果均與預(yù)期一致(圖略)。測(cè)序結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增獲得了大小分別為546 bp、561 bp、1 108 bp的基因序列，與GenBank登錄的參考豬源 IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β (融合基因)基因序列的同源性均達(dá)到99%。表明正確構(gòu)建了含從江香豬源IFN植物表達(dá)載體pBI121-IFN-α2、

圖1 IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β 基因的 PCR 擴(kuò)增(A)與各重組質(zhì)粒的PCR鑒定(B)Fig.1 Amplification of IFN-α2,IFN-β,IFN-α2β genes(A)and identification of the each recombinant plasmids(B)by PCR

2.2 從江香豬源IFN在生菜中瞬時(shí)表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果含從江香豬IFN質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染的生菜葉片經(jīng)GUS染色。因PBI121載體融合外源基因后存在啟動(dòng)子而表達(dá)GUS基因；而空載體不存在啟動(dòng)子，則不表達(dá)GUS基因。在適宜條件下，若生菜表達(dá)各從江香豬IFN，那么也能夠表達(dá)GUS。表達(dá)的GUS蛋白可以將GUS染液試劑盒中的X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物。結(jié)果觀察各干擾素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的生菜葉可見藍(lán)色產(chǎn)物，而轉(zhuǎn)染空載體的生菜葉未見藍(lán)色產(chǎn)物(圖2)，初步表明，從江香豬源 IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β蛋白在生菜葉中得到了瞬時(shí)表達(dá)。

圖2 從江香豬源IFN在生菜中表達(dá)的GUS得染色結(jié)果(10×40)Fig.2 GUS staining of lettuce transfected with Congjiangxiang porcine IFN(10×40)

2.3 從江香豬源干擾素生菜中瞬時(shí)表達(dá)蛋白的ELISA檢測(cè)結(jié)果 利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各IFN濃度，結(jié)果顯示IFN-α2濃度為1.71 mg/mL；IFN-β濃度為1.80mg/mL；IFN-α2β濃度為3.12mg/mL；空載體(VEC)表達(dá)的總蛋白濃度為2.45 mg/mL。將各干擾素濃度稀釋為1.50 mg/mL用于后續(xù)試驗(yàn)。

利用豬IFNα、IFN-β ELISA試劑盒檢測(cè)從江豬源各 IFN 的含量。結(jié)果顯示，IFN-α2、IFNα2β、IFN-β、IFN-α2β 蛋 白 含 量 均 值 分 別 為 3.25×10-8mg/mL、2.84×10-8mg/mL、1.51×10-7mg/mL、8.22×10-8mg/mL。進(jìn)一步表明從江香豬源 IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β在生菜中得到了瞬時(shí)表達(dá)，但其表達(dá)量偏低。

2.4 從江香豬源干擾素生菜中瞬時(shí)表達(dá)蛋白對(duì)PRRSV抑制作用檢測(cè)結(jié)果 采用qPCR檢測(cè)生菜中瞬時(shí)表達(dá)的從江香豬源 IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β 對(duì)PRRSV復(fù)制的抑制作用，結(jié)果顯示，從江香豬源IFN-α2、IFN-β蛋白對(duì)PRRSV復(fù)制具有顯著抑制作用(p＜0.01)，融合表達(dá)的從江香豬源 IFN-α2β 蛋白抑制PRRSV復(fù)制的效果更顯著(p＜0.002)(圖3)。將從江香豬源 IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β 4 倍倍比稀釋(41～410：3.75×10-1mg/mL～1.43×10-6mg/mL)處理Marc145細(xì)胞24 h，然后以100 TCID50PRRSV感染，觀察結(jié)果顯示，IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β 分別經(jīng)47、47、49稀釋后仍然能夠抑制 100 TCID50PRRSV的致CPE作用(表2)。表明融合表達(dá) IFN-α2β蛋白比單一 IFN-α2或IFN-β對(duì)PRRSV復(fù)制的抑制效果更顯著。

圖3 生菜中瞬時(shí)表達(dá)的從江香豬源IFN對(duì)PRRSV復(fù)制抑制作用的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Inhibition of PRRSV replication by transiently expressing IFNs from Congjiangxiang porcine in lettuce

表2 從江豬源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β 抑制 PRRSV的致CPE結(jié)果Table 2 The effect of congjiangxiang porcine IFN-α2,IFN-α2β,IFN-β on PRRSV induced CPE

3 討論

豬IFN作為抗病毒先天免疫中關(guān)鍵性的細(xì)胞因子，主要通過增強(qiáng)免疫球蛋白的受體表達(dá)，激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，從而干擾病毒的復(fù)制，屬于新型抗病毒蛋白質(zhì)類獸藥[13]。鄭鳴等通過大腸桿菌分別表達(dá)了豬IFN-α、豬IFN-β，均具有較好生物學(xué)活性[14]；鐘穎等[3]、劉敏等[4]、曹瑞兵[6]等用畢赤酵母表達(dá)豬IFN-α、豬IFN-β，表達(dá)產(chǎn)物也均具有較好的抗病毒活性。但以上各表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬的IFN具有可操作性強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但缺少真核細(xì)胞的細(xì)胞器，不能進(jìn)行糖基化修飾及翻譯。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)雖具有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的良好可操作性和真核細(xì)胞的表達(dá)加工能力，但存在產(chǎn)量低及過度糖基化等問題[15]。因此有必要尋找一種新的經(jīng)濟(jì)、安全、快速、高產(chǎn)的豬源IFN表達(dá)體系。

植物表達(dá)體系具有高效、低廉、制備方法簡單和規(guī)?；a(chǎn)等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，ProdiGene公司用玉米表達(dá)了β-葡萄糖醛酸酶、胰蛋白酶和抗生物素蛋白；美國Ventria公司在水稻中表達(dá)了人乳鐵蛋白、人溶菌酶等，均被批準(zhǔn)作為精細(xì)化學(xué)產(chǎn)品投放市場(chǎng)[16]。生菜具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，生長周期短，外源基因轉(zhuǎn)入生菜中的轉(zhuǎn)化效率較高，同時(shí)還可以避免藥物蛋白在加熱中的變性，是一種用來表達(dá)外源蛋白的良好宿主植物[17]。本研究中從江香豬源IFN在生菜中的表達(dá)量相對(duì)于羅熹等在生菜中表達(dá)的雞IFN-γ[18]、李靜在生菜中表達(dá)的人IFN-β的表達(dá)量偏低[19]，推測(cè)可能受菌株限制，還有基因在生菜中的表達(dá)時(shí)間、蛋白提取方法、表達(dá)后檢測(cè)時(shí)間等因素的影響，本實(shí)驗(yàn)室將開展采用不同菌株在生菜中表達(dá)從江香豬源的IFN，通過優(yōu)化表達(dá)時(shí)間、蛋白提取方式、表達(dá)后檢測(cè)時(shí)間等因素，以期獲得更高的表達(dá)量，為從江香豬IFN蛋白的深入研究提供實(shí)驗(yàn)材料。

一個(gè)合理的動(dòng)物源蛋白表達(dá)體系要實(shí)現(xiàn)價(jià)格低廉、安全、可控，而最主要問題就是保證植物表達(dá)蛋白的活性[20]，以便用于治療動(dòng)物疾病。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法已經(jīng)被用來生產(chǎn)抗體分子[21]或糖基蛋白[20]。但是關(guān)于來源于該體系的動(dòng)物源蛋白研究報(bào)道較少，本研究中證明了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的從香江豬源IFN在生菜中的瞬時(shí)表達(dá)可以生產(chǎn)出高活性的IFN，同時(shí)融合從江豬源干擾素蛋白IFN-α2β具有天然從江豬源IFN的活性，對(duì)PRRSV的復(fù)制具有較強(qiáng)的抑制作用，顯著優(yōu)于IFN-α2或IFN-β或IFN-α2+IFN-β對(duì) PRRSV復(fù)制的抑制作用，與鄭鳴等在大腸桿菌中融合表達(dá)的豬IFN-α、IFN-β抗病毒活性結(jié)果一致[14]。該結(jié)果對(duì)抗PRRSV新型豬源IFN融合蛋白獸藥的研制提供參考依據(jù)。同時(shí)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法也可以作為未來生產(chǎn)豬源融合蛋白的一種有效方式。