嵇少澤，高云航，勾長龍，張喜慶，王 羽，田佳琪，李 晨

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118)

巴氏桿菌為條件致病菌，可以通過患病動(dòng)物的排泄物、分泌物不斷向健康動(dòng)物傳播[1]。多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，PM)主要引起出血性敗血癥或呼吸系統(tǒng)疾病[2]，且不同血清型PM與致病性有著一定的關(guān)聯(lián)。目前，在我國發(fā)現(xiàn)的牛巴氏桿菌病主要是由A型和B型巴氏桿菌引起。莢膜血清B型主要引起牛出血性敗血癥[3]，莢膜血清A型是導(dǎo)致犢牛急性纖維素性與出血性肺炎的主要致病菌。我國自2008年報(bào)道關(guān)于牛感染A型PM的病例以來[4]，其已經(jīng)導(dǎo)致各地犢牛批量死亡，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外尚缺乏針對(duì)牛A型PM的疫苗，需要進(jìn)一步篩選有效的抗原蛋白。

rpoE是一種sigma因子，控制基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯，在維持細(xì)菌的生長和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起重要的作用。王林柏等對(duì)小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果首次鑒定rpoE是PM的一種毒力因子，可以作為減毒疫苗的候選蛋白[5]。在人齲齒病原鏈球菌[6]、類鼻疽桿菌[7]及巴爾通體[8]的研究中表明，rpoE對(duì)細(xì)菌的生長以及抵抗環(huán)境壓力均具有重要作用；大腸桿菌在高滲[9]、碳缺乏[10]以及低溫環(huán)境情況下[11]，一旦缺失rpoE，其生存能力就會(huì)降低，可見rpoE蛋白在大腸桿菌許多蛋白及其基因的激活反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在PM中對(duì)rpoE蛋白了解較少且缺乏深層次的研究，尤其在A型PM免疫保護(hù)方面的問題有待闡明。本研究首次在原核系統(tǒng)中表達(dá)了牛源A型PM rpoE重組蛋白，經(jīng)純化后免疫小鼠，間接ELISA檢測血清中特異性抗體效價(jià)；強(qiáng)菌株腹腔攻毒并記錄小鼠的死亡情況，評(píng)估rpoE蛋白的免疫特性，為評(píng)價(jià)A型PM rpoE蛋白在研發(fā)牛PM亞單位疫苗提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 牛源A型PM強(qiáng)菌株M18-70、PM小鼠陽性血清以及pET-28a表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；6周齡BALB/c小鼠由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞及山羊抗鼠IgG購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑及DNA聚合酶購自Sigma公司；Ni-NTA親和層析介質(zhì)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；T4連接酶、BCA蛋白定量測定試劑盒及Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與XhoⅠ、10×TBST緩沖液、IPTG及細(xì)菌基因組提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 基于牛源A型PM M18-70株的rpoE基因序列(29389484)，采用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)具有特定酶切位點(diǎn)的引物(P1：5'-CAGGATCCATGG CTGAACAGCTAA-3'/P2：5'-CGCTCGAGTTAACGTT GCAACATAG-3')，預(yù)計(jì)擴(kuò)增基因片段為592 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 rpoE基因的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取M18-70株的基因組DNA作為模板，P1/P2為引物，PCR擴(kuò)增rpoE基因片段?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物后克隆至pET-28a載體，提取質(zhì)粒后經(jīng)PCR及雙酶切鑒定。陽性克隆由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-rpoE。

1.4 重組蛋白的表達(dá)、純化及western blot鑒定將重組質(zhì)粒pET-28a-rpoE轉(zhuǎn)化DE3(BL21)感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單菌落，于LB液體培養(yǎng)基中(含有Kana 1‰)37℃增菌培養(yǎng)，待細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長期時(shí)加入IPTG(終濃度1 mmol/L)誘導(dǎo)6 h。收集菌體超聲波破碎后分別取50 μL上清和50 μL沉淀重懸液，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白表達(dá)情況。對(duì)提取蛋白經(jīng)層析法分離純化后，按照Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆?。?0 μL純化后的rpoE蛋白，以PM小鼠陽性血清(1∶20)為一抗，山羊抗鼠 HRP-IgG(1∶5 000)為二抗，采用western blot鑒定重組蛋白的反應(yīng)原性。

1.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 取20只6周齡BALB/c小鼠，隨機(jī)分為免疫組和對(duì)照組，每組10只。免疫組小鼠經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射100 μg純化的rpoE蛋白(弗氏完全佐劑乳化)首免，一周后二免(弗氏不完全佐劑乳化)，間隔一周后三免(弗氏不完全佐劑乳化)；對(duì)照組注射等體積PBS(對(duì)應(yīng)弗氏佐劑乳化)。一周后，對(duì)所有小鼠腹腔注射M18-70菌液(1×102cfu/mL)0.5 mL(2 LD50)攻毒，連續(xù)觀察7 d。記錄各組小鼠的死亡情況，判定疫苗的免疫保護(hù)效力。

三免7 d后，分別對(duì)各組小鼠經(jīng)眼球靜脈采血并分離血清。將純化的rpoE重組蛋白(1 μg/mL)包被酶標(biāo)板，利用間接ELISA方法[12]檢測融合蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體水平，用酶標(biāo)儀測定OD490nm時(shí)每孔的讀數(shù)，P/N＞5.6為陽性。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-rpoE經(jīng)PCR鑒定，結(jié)果顯示在600 bp的位置出現(xiàn)目的基因片段；酶切鑒定結(jié)果顯示，質(zhì)粒經(jīng)酶切后出現(xiàn)約3 000 bp的載體片段，以及大小約600 bp的目的基因片段，片段大小與預(yù)期結(jié)果(592 bp)一致(圖1)。測序結(jié)果顯示插入的外源基因序列正確，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-rpoE。

圖1 重組質(zhì)粒pET-28a-rpoE的PCR鑒定與酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid by PCR and digested withBamHⅠ andXhoⅠ

2.2 rpoE重組蛋白的表達(dá)及western blot鑒定 將重組質(zhì)粒pET-28a-rpoE轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，目的蛋白大小約20 ku，與預(yù)期相符(圖2A)，用BCA蛋白定量測定試劑盒測得純化后的目的蛋白濃度為8 mg/mL，純度可達(dá)90%以上。將純化后的rpoE蛋白經(jīng)western blot鑒定，結(jié)果顯示目的蛋白能夠與小鼠PM陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合(圖2B)。表明rpoE蛋白具有較強(qiáng)的特異性和較好的反應(yīng)原性。

2.3 重組蛋白的免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 利用rpoE重組蛋白免疫小鼠，三免7 d后，對(duì)所有小鼠采血檢測其抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，在重組rpoE蛋白三免小鼠7 d后，免疫小鼠血清的抗效價(jià)效價(jià)均在3 000以上，而PBS對(duì)照小鼠血清未檢測到相應(yīng)抗體(圖3)，表明融合蛋白具有較好的免疫原性，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的抗體。三免7 d后對(duì)所有小鼠攻毒，結(jié)果顯示重組rpoE蛋白免疫組小鼠死亡3只，其余小鼠生存狀態(tài)良好，存活7 d以上，保護(hù)率為70%；PBS對(duì)照組小鼠在攻毒后2 d內(nèi)全部死亡(圖4)。表明重組蛋白rpoE對(duì)免疫小鼠具有較好的免疫保護(hù)力。

圖2 重組蛋白rpoE的SDS-PAGE檢測(A)和western blot鑒定(B)Fig.2 Analysis of the prokaryotically expressed recombinant protein by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

圖3 重組蛋白對(duì)BALB/c小鼠的免疫保護(hù)效果Fig.3 Protection of recombinant rpoE immunized BALB/c mice against PM challenging

圖4 免疫小鼠血清中rpoE特異性抗體效價(jià)檢測Fig.4 The antibody levels in immunized mice induced by the recombinant protein

3 討論

A型PM是牛呼吸道疾病綜合征的主要病原體之一，毒力較強(qiáng)。該病原主要引起犢牛急性纖維素性與出血性肺炎，感染動(dòng)物的死亡率較高，發(fā)病常呈流行性，嚴(yán)重危害牛群的健康。前些年，我國牛群感染的PM以莢膜B型為主，近年來研究者不斷從我國多地區(qū)牛場中分離到莢膜A型PM。在實(shí)際生產(chǎn)中，注射疫苗是防控該類疾病最經(jīng)濟(jì)可行的方法。目前國內(nèi)的巴氏桿菌疫苗菌株均為B型[13]，尚無商品化疫苗用于防控A型PM引起的疾病，所以開發(fā)免疫效果好的A型PM疫苗成為近年來研究的熱點(diǎn)。

rpoE是普遍存在于細(xì)菌中的一類調(diào)節(jié)基因，在許多環(huán)境中均發(fā)揮重要的作用。rpoE基因的缺失對(duì)細(xì)菌的毒力有較大影響，如鼠傷寒沙門菌rpoE基因缺失株毒力顯著下降[14]；羊種布魯氏菌rpoE缺失株在小鼠感染模型中生存及致病能力顯著低于親本菌株，其它食源性致病菌中rpoE基因的缺失突變均會(huì)引起其毒力下降[15]，表明rpoE在細(xì)菌致病過程中是一種至關(guān)重要的致病因子。但rpoE蛋白在PM中的研究很少，尤其在A型PM免疫保護(hù)方面的問題有待闡明。本研究在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了牛源A型PM rpoE蛋白，表達(dá)的重組rpoE蛋白可以特異性結(jié)合PM感染小鼠的陽性血清。這表明rpoE蛋白免疫小鼠后，機(jī)體產(chǎn)生了相應(yīng)抗PM感染的過程，提示該蛋白具有作為牛源A型PM候選疫苗抗原的潛力。ELISA檢測結(jié)果顯示，rpoE蛋白可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，具有較好的免疫原性。此外，重組rpoE蛋白免疫小鼠后能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可以一定程度保護(hù)小鼠免受牛源A型PM的攻擊，保護(hù)率達(dá)到70%。本研究為進(jìn)一步開展牛源A型PM的診斷技術(shù)和免疫學(xué)等研究奠定了良好基礎(chǔ)。