葉 勖 陳明偉 高 宇 李夢潔 王 彤 邢珊珊 黃 暢 沈益民

(浙江醫(yī)院血液科，杭州 310030)

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；抗體CD29-PE、CD44-FITC、CD105-FITC、CD45-PE、CD34-FITC、IgG1-FITC和IgG2a-PE均購自美國Becton Dickinson公司；一抗anti-caspase-3和anti-GAPDH 購自美國Cell signaling technology公司；二抗HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit 購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Europium標(biāo)記試劑盒購自美國Abnova公司；Lipofectamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司；miR-378 mimic、inhibitor及陰性對照由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康雄性SD大鼠20只，鼠齡4～5周，體質(zhì)量100～150 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：SCXK (湘)2013-0004，同一條件下標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1rBMSCs的分離與培養(yǎng) 采用10%水合氯醛(500 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，無菌條件下暴露大鼠雙側(cè)股骨，使用20 ml注射器針頭在股骨兩端鉆直徑約1.5 mm的小孔，使用規(guī)格為5 ml的注射器吸取5 ml含10%FBS的DMEM/F12(1∶1)完全培養(yǎng)基，從股骨一端緩慢沖洗骨髓腔，另一端收集細(xì)胞懸液，縫合大鼠皮膚，術(shù)后肌肉注射慶大霉素抗菌。采用200目篩網(wǎng)對收集的細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，1 500 r/min 離心5 min，吸取乳白色、云霧狀液體層，PBS重懸后再次離心，1 400 r/min離心4 min，棄上清，重復(fù)操作2次。采用DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后半量換液，隨后2～3 d換液1次，待細(xì)胞達(dá)到90 %的密度時進(jìn)行傳代。

1.2.2rBMSCs的鑒定 取第3代生長狀態(tài)良好的rBMSCs，制成細(xì)胞懸液(1×105個/ml)，分別加入異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)熒光標(biāo)記的CD29-PE、CD44-FITC、CD105-FITC、CD45-PE、CD34-FITC和同型陰性對照IgG1-FITC和IgG2a-PE，避光冰上孵育45 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，流式細(xì)胞儀檢測rBMSCs表面抗原CD29、CD44、CD105、CD45和CD34的表達(dá)情況。另取第3代生長狀態(tài)良好的rBMSCs，接種于6孔板中培養(yǎng)，待生長達(dá)到60%融合后，在各種誘導(dǎo)孔中加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基2 ml(內(nèi)含誘導(dǎo)劑1 mmol/L地塞米松、1 mol/L β-甘油磷酸鈉和50 mmol/L抗壞血酸)。每隔3 d更換一次成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)21 d后，經(jīng)4%多聚甲醛固定，對誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞進(jìn)行茜素紅和堿性磷酸酶染色觀察。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及miR-378 檢測取第3代生長狀態(tài)良好的rBMSCs接種于6孔板，按照Lipofectamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染miR-378 mimic、miR-378 inhibitor以及陰性對照(NC)，終濃度為10 μmol/L。37℃培養(yǎng)4～6 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照Trizol試劑盒說明書提取各轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(16℃，30 min；42℃，40 min；85℃，5 min)合成cDNA，并配置PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個PCR循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-378相對表達(dá)量。引物序列，miR-378-RT：5′-GTCGTAATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGAT-ACGACGCCTTCT-3′；miR-378-F：5′-GGGACTGGAC TTGGAGTCA-3′；miR-378-R：5′-GTGCGTGTCGTGG-ACTCG-3′。

1.2.4血清制備及分組處理 大鼠頸靜脈取血3 ml，加入0.2 ml抗凝劑EDTA·Na2混勻，靜置30 min，4℃，3 500 r/min，離心15 min，取上層血清，-20℃保存?zhèn)溆谩０凑蘸罄m(xù)實(shí)驗(yàn)需要分組如下：①空白對照組(Control)：rBMSCs不與大鼠異體血清(Allogeneic rat serum，ARS)共孵育；②異體血清組(ARS)：rBMSCs與10%的ARS共孵育；③miR-378 inhibitor+ARS組(inhibitor+ARS)：轉(zhuǎn)染miR-378 inhibitor后的rBMSCs與10%的ARS共孵育；④miR-378 mimic+ARS組(mimic+ARS)：轉(zhuǎn)染miR-378 mimic后的rBMSCs與10%的ARS共孵育；⑤陰性對照+ARS組(NC+ARS)：轉(zhuǎn)染miR-378 陰性對照后的rBMSCs與10%的ARS共孵育。

黨的十八大以來，習(xí)近平總書記鮮明提出了新時代好干部標(biāo)準(zhǔn)和忠誠干凈擔(dān)當(dāng)、“三嚴(yán)三實(shí)”、“四有”、“四個鐵一般”等要求,特別是在2018年全國組織工作會上，他進(jìn)一步指出，選干部就是要堅(jiān)持好干部標(biāo)準(zhǔn)，把政治標(biāo)準(zhǔn)放在第一位。政治標(biāo)準(zhǔn)是硬杠杠，如果政治標(biāo)準(zhǔn)不合格，能耐再大也不能用。習(xí)近平總書記這些選人用人思想，歸結(jié)起來就是干部首先要在政治上達(dá)標(biāo)，選人用人首先要看政治素質(zhì)。

1.2.5MTT檢測 取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以1×103個/孔接種于96孔板中，待生長達(dá)到90%融合后分組處理，37℃共孵育2 h。棄培養(yǎng)基，每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml)，避光孵育4 h，棄上清再加入100 μl DMSO，輕輕振蕩10 min，待紫色甲瓚顆粒完全溶解后，使用酶標(biāo)儀在波長為570 nm處測量OD值，取均值計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以3×105個/孔接種于6孔板中，待生長達(dá)到90%融合后分組處理，37℃共孵育2 h。按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/ml，經(jīng)離心、洗滌后加入500 μl incubation buffer懸細(xì)胞，再分別加入5 μl Annexin-FITC和5 μl PI充分混勻，避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.7Western blot檢測caspase-3蛋白的表達(dá) 取各組細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿中，待生長達(dá)到90%融合后分組處理，37℃共孵育2 h。收集細(xì)胞沉淀，加入適量RIPA全蛋白裂解液，冰上充分裂解30 min后，4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。取25 μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，使用5%脫脂牛奶室溫孵育1 h，根據(jù)蛋白marker顯示的位置進(jìn)行裁膜，分別加入一抗 anti-caspase-3(1∶1 000)和anti-GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBS洗滌3次，加入二抗HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h，TBS洗滌3次，ECL發(fā)光顯色，采用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)自動顯影與數(shù)據(jù)分析。

1.2.8BMSCs活體移植的殺傷檢測 取生長狀態(tài)良好的rBMSCs以及轉(zhuǎn)染miR-378 inhibitor、mimic和 NC后的rBMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，0.25%胰酶消化，4℃，1 500 r/min 離心5 min，制備成3×106個/ml的細(xì)胞懸液，分別加入10 μmol/L的Europium，37℃共孵育30 min。被Europium標(biāo)記的各組細(xì)胞，取0.5 ml 細(xì)胞懸液(5×105個)通過尾靜脈移植到異體大鼠體內(nèi)，每組3只大鼠。分別于注射后20、40、60和80 min眼眶靜脈取血，分離血清。按照1∶50比例使用PBS稀釋血清，熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長650 nm和發(fā)射波長660 nm處檢測rBMSCs破損后泄露到大鼠體內(nèi)的Europium濃度，以泄露到血清中Europium濃度的高低間接評估rBMSCs異體移植到活體內(nèi)的存活率。計(jì)算活體移植細(xì)胞殺傷率，其計(jì)算公式如下：殺傷率=(A-B)/(C-B)×100%，其中A為釋放的平均量，B為最低釋放量，C為最大釋放量。

2 結(jié)果

2.1rBMSCs的鑒定 由圖1可見，第3代rBMSCs細(xì)胞表面CD29、CD44和CD105呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率依次為(83.4±4.3)%、(93.1±3.9)%和(75.9±2.3)%；而CD45和CD34呈陰性表達(dá)，表達(dá)率僅為(3.0±0.9)%和(4.6±1.1)%。rBMSCs體外成骨誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示rBMSCs礦化能力顯著增強(qiáng)，存在大量紅色陽性克隆的鈣化結(jié)節(jié)；堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示rBMSCs出現(xiàn)較多藍(lán)黑色顆粒和塊狀深染顆粒，部分細(xì)胞膜呈現(xiàn)黑色線狀，如圖2所示。

2.2rBMSCs中miR-378表達(dá) 如圖3所示，miR-378 mimic及inhibitor轉(zhuǎn)染rBMSCs后，與Control組比較，miR-378 mimic可顯著提高rBMSCs中miR-378的表達(dá)(P<0.05)。同時，與Control組比較，miR-378 inhibitor也可顯著抑制rBMSCs中miR-378的表達(dá)(P<0.05)。NC組rBMSCs中miR-378與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測rBMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)Fig.1 Detected expression of surface markers of rBMSCs by flow cytometry

2.3miR-378對異體血清干預(yù)下rBMSCs存活率的影響 如圖4所示，與Control組比較，ARS組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。與ARS組比較，inhibi-tor+ARS組存活率顯著降低(P<0.05)。另外，mim-ic+ARS組細(xì)胞存活率顯著高于ARS組(P<0.05)。NC+ARS組細(xì)胞存活率與ARS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4miR-378對異體血清干預(yù)下rBMSCs凋亡的影響 如圖5所示，與Control組凋亡率(10.1±1.4)%比較，ARS組凋亡率(30.7±3.3)%顯著增高(P<0.05)。與ARS組比較，inhibitor+ARS組凋亡率(39.1±4.7)%顯著升高(P<0.05)；另外mimic+ARS組凋亡率(18.7±1.9)%與ARS組比較則顯著降低(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，ARS組Caspase-3蛋白切割激活顯著增高(P<0.05)；與ARS組比較，mimic+ARS組Caspase-3蛋白切割激活則又顯著下調(diào)。另外，inhibitor+ARS組Caspase-3切割蛋白表達(dá)相較于ARS組則又顯著上調(diào)(P<0.05)，如圖6。

2.5miR-378對活體移植中rBMSCs存活的影響

圖2 rBMSCs成骨分化誘導(dǎo)21 d后染色觀察(×200)Fig.2 Osteoblasts induction of rBMSCs at 21 d (×200)Note: A.Alizarin red staining;B.Alkaline phosphatase staining.

圖3 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后rBMSCs中miR-378的表達(dá)Fig.3 Detected expression of miR-378 in transfected rBMSCs by RT-PCRNote:

如圖7所示，各組rBMSCs活體移植后，隨著時間的延長，各組rBMSCs在大鼠體內(nèi)損傷情況呈上升趨勢。在活體內(nèi)miR-378 mimic轉(zhuǎn)染的rBMSCs所受到的殺傷率在各時間點(diǎn)都要低于Control組，且在活體移植后的80 min時顯著低于Control組(P<0.05)。miR-378 inhibitor轉(zhuǎn)染的rBMSCs所受到的殺傷率在各時間點(diǎn)都要高于Control組，且在移植后60 min時，其所受殺傷率顯著高于Control組(P<0.05)。而NC組與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 異體血清對各組rBMSCs存活率的影響Fig.4 Effect of allogeneic serum on survival rate of rBMSCsNote: vs control group；#.P<0.05 vs ARS group.

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測異體血清對rBMSCs凋亡的影響Fig.5 Detected effect of allogeneic serum on apoptosis of rBMSCs by flow cytometryNote: vs control group；#.P<0.05 vs ARS group.

圖6 Western blot檢測異體血清對rBMSCs中凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)的影響Fig.6 Evaluated effect of allogeneic serum on protein expression of Caspase-3 of rBMSCs by Western blotNote: vs control group；#.P<0.05,##.P<0.01 vs ARS group.

圖7 rBMSCs異體活體移植后受機(jī)體殺傷情況Fig.7 Survival condition of rBMSCs in vivo after xenoge-nous transplantationNote:

3 討論

BMSCs是細(xì)胞治療中運(yùn)用最為廣泛的一類干細(xì)胞，具有易取材、易擴(kuò)增、低免疫源性等優(yōu)點(diǎn)，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為骨缺損修復(fù)、心肌梗死、自身免疫性疾病、慢性頑固性心絞痛等疾病的首選方法[10]。但是BMSCs移植治療的效果并不理想，有證據(jù)表明BMSCs移植后在機(jī)體內(nèi)存活率較低是限制其治療效果的重要因素。例如，Amsalem等[11]采用氧化鐵標(biāo)記的MRI技術(shù)監(jiān)測移植BMSCs的存活情況，發(fā)現(xiàn)心機(jī)梗死區(qū)移植后24 h存活的BMSCs明顯減少，下降近50%，一個月后基本檢測不到BMSCs的存活。王月秋等[12]采用綠色熒光蛋白標(biāo)記BMSCs移植注射至兔椎間盤，發(fā)現(xiàn)移植后6、8周髓核內(nèi)的熒光細(xì)胞數(shù)量明顯少于移植后1、2、4周，也證實(shí)BMSCs移植后在機(jī)體內(nèi)存活率隨時間的延長而逐漸降低。因此，如何提高BMSCs移植后存活率成為干細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化面臨的首要問題。

miRNAs是一類生物進(jìn)化過程中高度保守的內(nèi)源表達(dá)的小分子非編碼RNA，廣泛參與多種生理病理過程，其中miR-378在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移等方面具有重要的作用。Li等[13]研究顯示，過表達(dá)miR-378可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖。Fang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-378可增強(qiáng)大鼠心肌細(xì)胞對缺血缺氧環(huán)境的難受性，而若抑制miR-378則可加重心肌細(xì)胞損傷和凋亡。因此，miR-378可能對細(xì)胞存活具有促進(jìn)作用。然而，目前有關(guān)miR-378對干細(xì)胞的調(diào)控影響的研究報道甚少。本研究通過過表達(dá)或抑制miR-378表達(dá)的方式改造BMSCs，發(fā)現(xiàn)miR-378過表達(dá)可提高BMSCs異體移植的存活率，本研究結(jié)果可能為克服BMSCs移植存活率低的問題提供了新的解決途徑。

本研究采用密度梯度離心法分離大鼠BMSCs，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測rBMSCs表面標(biāo)志物及細(xì)胞成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)本實(shí)驗(yàn)中所分離的細(xì)胞為BMSCs。隨后采用miR-378 mimic及inhibitor轉(zhuǎn)染rBMSCs，RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-378 mimic轉(zhuǎn)染后可顯著提高rBMSCs中miR-378的表達(dá)，miR-378 inhibitor轉(zhuǎn)染則可顯著抑制rBMSCs中miR-378的表達(dá)，說明成功干預(yù)rBMSCs中miR-378的表達(dá)。免疫系統(tǒng)的排斥作用是導(dǎo)致異體移植療效不理想的直接原因，正常人與動物血清中含有一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)可以攻擊外源移植干細(xì)胞產(chǎn)生防御作用，直接導(dǎo)致移植干細(xì)胞損傷或死亡[15]，因此本研究采用大鼠血清與rBMSCs共培養(yǎng)體外模擬異體移植過程。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rBMSCs與異體大鼠血清共培養(yǎng)2 h后，rBMSCs存活率顯著下降；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與異體大鼠血清共培養(yǎng)的rBMSCs凋亡率顯著高于Control組，且Western blot結(jié)果也顯示與異體大鼠血清共培養(yǎng)的rBMSCs中Caspase-3切割激活顯著高于Control組。說明，異體大鼠血清對rBMSCs的殺傷作用較大。鄭盛等[16]也證實(shí)正常人血清對rBMSCs具有較高的殺傷作用。

隨后通過過表達(dá)或抑制rBMSCs中miR-378，觀察其對異體大鼠血清孵育條件下rBMSCs存活的影響。MTT結(jié)果顯示，與異體大鼠血清共培養(yǎng)的rBMSCs相比較，過表達(dá)miR-378可提高同條件下rBMSCs的存活率，抑制miR-378表達(dá)則可繼續(xù)降低rBMSCs的存活率。說明，miR-378對異體大鼠血清共孵育條件下rBMSCs的存活具有促進(jìn)作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-378可抑制異體大鼠血清共孵育條件下rBMSCs的凋亡，抑制miR-378則促進(jìn)rBMSCs的凋亡。Western blot結(jié)果顯示，異體大鼠血清共孵育條件下，過表達(dá)miR-378可抑制rBMSCs中Caspase-3的切割激活，抑制miR-378則促進(jìn)rBMSCs中Caspase-3的切割激活。說明，miR-378可抑制異體大鼠血清共孵育條件下rBMSCs的凋亡。郭天柱等[17]研究也顯示，過表達(dá)miR-378可顯著促進(jìn)缺氧條件下rBMSCs的生長增殖，并抑制細(xì)胞凋亡。另外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們采用Europium標(biāo)記rBMSCs進(jìn)行活體移植。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-378 mimic的rBMSCs在大鼠體內(nèi)各時間段存活率均顯著高于Contorl組和轉(zhuǎn)染miR-378 inhibitor組。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)說明，miR-378可以促進(jìn)異體移植過程中BMSCs的存活。針對miR-378提高異體移植過程中BMSCs存活率的具體機(jī)制，可能與體液免疫中補(bǔ)體系統(tǒng)活化有關(guān)。有研究表明，在異體移植過程中補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后，形成攻膜復(fù)合物，可裂解外源細(xì)胞，導(dǎo)致移植干細(xì)胞的存活率較低[18]。因此，miR-378是否是通過靶向抑制補(bǔ)體活化而發(fā)揮作用將成為我們下一步研究重點(diǎn)。

綜上所述，異體移植過程中因機(jī)體免疫反應(yīng)可導(dǎo)致BMSCs存活率較低，而過表達(dá)miR-378則可提高異體移植過程中BMSCs的存活率，并抑制BMSCs凋亡，本研究結(jié)果可為解決BMSCs移植存活率低的問題提供新的思路。