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        桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的重組禽腺聯(lián)病毒的鑒定

        2019-09-02 14:01:46崔瀟婷顧玲玲吳萌張繼玲王安平
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年5期
        關(guān)鍵詞:鑒定

        崔瀟婷 顧玲玲 吳萌 張繼玲 王安平

        摘要:為對桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的重組禽腺聯(lián)病毒進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定,將含GFP報告基因及AAAV兩側(cè)末端重復(fù)序列的重組桿狀病毒rBac-GFP、表達(dá)AAAV結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒rBac-VP、表達(dá)AAAV功能蛋白的重組桿狀病毒rBac-Rep以感染復(fù)數(shù)為5,同時感染搖瓶培養(yǎng)中的昆蟲細(xì)胞Sf9,72 h后收集細(xì)胞沉淀,反復(fù)凍融3~5次后,離心取上清。經(jīng)濾膜過濾、氯仿抽提和PEG沉淀后,進(jìn)行電鏡觀察和Western blot分析,并體外感染雞成纖維細(xì)胞和雞肝細(xì)胞系。SDS-PAGE結(jié)果顯示,rAAAV得到了較好的純化,電鏡下可觀察到大小約20 nm的典型細(xì)小病毒樣粒子,Western blot分析數(shù)據(jù)顯示rAAAV由3個結(jié)構(gòu)蛋白組成,與野生病毒相似。體外表達(dá)試驗結(jié)果顯示,rAAAV能介導(dǎo)GFP報告基因在雞細(xì)胞中穩(wěn)定持久地表達(dá)。表明桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的rAAAV具有與野生病毒相似的性質(zhì),可應(yīng)用于后繼研究和開發(fā)應(yīng)用。

        關(guān)鍵詞:重組禽腺聯(lián)病毒;桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng);鑒定

        中圖分類號:S852.65?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A? 文章編號:1002-1302(2019)05-0153-03

        收稿日期:2017-11-21

        基金項目:國家自然科學(xué)基金(編號:31302096);江蘇省科技支撐計劃(編號:BE2013415);江蘇省六大人才高峰項目(編號:NY-009)。

        作者簡介:崔瀟婷,女,江蘇如皋人,講師,主要從事獸用生物制藥的研究。E-mail:419445466@qq.com。

        通信作者:王安平,博士,副教授,主要從事獸用生物制藥的研究。E-mail:wap4017@163.com。

        腺聯(lián)病毒(adeno-associated virus,AAV)又稱腺病毒相關(guān)病毒,作為一種新型的病毒載體,與其他重組病毒載體相比較,具有對宿主沒有致病性、免疫原性極低、宿主范圍廣、表達(dá)時間持久等優(yōu)點(diǎn)[1],因此被認(rèn)為是一種比較理想的基因轉(zhuǎn)移載體,目前廣泛地用于基因治療和基因工程疫苗等方面的研究。rAAV已有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)了小鼠和靈長類動物的多個組織和細(xì)胞,并能介導(dǎo)外源基因在肺臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、視網(wǎng)膜及骨骼肌等器官和組織中的長期表達(dá)[2-6]。

        禽腺聯(lián)病毒(avian adeno-associated virus,AAAV)于1973年由Yates等首次發(fā)現(xiàn)并報道[7],AAAV的理化性質(zhì)、基因組結(jié)構(gòu)等與AAV基本相似,提示可作為有潛力的重組病毒載體開發(fā)應(yīng)用[8-9]。目前,重組禽腺聯(lián)病毒的制備方法主要是三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法,即將順式(攜帶ITR 和外源基因)、反式(編碼rep和cap)和輔助基因的3 種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞系,這種方法成本偏高、程序較繁、不宜擴(kuò)大生產(chǎn),且獲得的重組禽腺聯(lián)病毒滴度偏低。2002年,Masahi 等發(fā)現(xiàn)Rep78在昆蟲細(xì)胞Sf9中無需輔助病毒或質(zhì)粒就能支持AAV DNA復(fù)制[10],將重組桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)應(yīng)用于rAAV的生產(chǎn),這種方法克服了傳統(tǒng)三質(zhì)粒法的技術(shù)難關(guān),rAAV滴度大大提高,生產(chǎn)出的rAAV與使用293細(xì)胞生產(chǎn)得到的病毒載體在生物功能上沒有差異,桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞懸浮生產(chǎn)系統(tǒng)被證明是一種簡單、高效、經(jīng)濟(jì)的可以大規(guī)模生產(chǎn)的方法。

        本實(shí)驗室首次利用重組桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)制備rAAAV的生產(chǎn),本研究對昆蟲細(xì)胞制備的rAAAV進(jìn)行以系列的鑒定,為rAAAV的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 載體和細(xì)胞

        含GFP報告基因及AAAV兩側(cè)末端重復(fù)序列的重組桿狀病毒rBac-GFP,表達(dá)AAAV結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒rBac-VP,表達(dá)AAAV功能蛋白的重組桿狀病毒rBac-Rep均由筆者所在實(shí)驗室構(gòu)建并保存;Sf9細(xì)胞購自Invitrogen公司;雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)用9~11日齡SPF雞胚制備;雞胚肝細(xì)胞系(CEL)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物制品工程技術(shù)中心提供。

        1.2 工具酶和試劑

        昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM(Serum free medium),購自GBICO公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

        1.3 rAAAV-GFP的制備

        參照文獻(xiàn)[11]的方法,將Sf9昆蟲細(xì)胞以5×105 cells/mL 的初始密度接種于搖瓶中的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基,110 r/min 27 ℃振搖培養(yǎng),至密度達(dá)2×106 cells/mL時,以MOI為5,接種3種重組桿狀病毒rBac-GFP、rBac-VP、rBac-Rep。3 d后,離心收集細(xì)胞沉淀,于-80 ℃、37 ℃反復(fù)凍融3~5次,12 000 r/min離心10 min,收集上清,即為含GFP報告基因的重組禽腺聯(lián)病毒rAAAV-GFP。

        1.4 rAAAV-GFP的純化

        將以上制備的病毒液先用0.22 μm的濾膜過濾,除去雜質(zhì)和大分子蛋白,再加入1/10體積的氯仿在搖床上室溫劇烈振搖1 h,加入5 mol/L NaCl至終濃度為1 mol/L,12 000 r/min 離心10 min,取上層水相,加入PEG 8000至終濃度為10%,冰浴 1 h,12 000 r/min離心15 min,PBS溶解沉淀,即為純化的rAAAV-GFP。

        1.5 rAAAV-GFP的電鏡鑒定

        將純化的重組病毒rAAAV-GFP滴加于銅網(wǎng)上,經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染后,在投射電鏡下觀察。

        1.6 rAAAV-GFP的Western blot分析

        取少量的rAAAV-GFP純化產(chǎn)物,與等體積的2×loading buffer混勻后,煮沸3 min,取15 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析,以未接種病毒的細(xì)胞沉淀作為陰性對照。樣品電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印PVDF膜,以鼠抗VP3多抗作為一抗,以HRP標(biāo)記的羊抗鼠作為二抗,按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot分析。

        [6]Xiao X A,Li J A,Samulski R J. Efficient long-term gene transfer into muscle tissue of immunocompetent mice by adeno-associated virus vector[J]. Journal of Virology,1996,70(11):8098-8108.

        [7]Yates V J,El-Mishad A M,McCormick K J,et al. Isolation and characterization of an avian adenovirus-associated virus[J]. Infec Immun,1973(7):973-980.

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        [11]Wang A P,Wang Y J,Wu S,et al. Efficient production of an avian adeno-associated virus vector using insect cell/baculovirus expression system[J]. Journal of Virological Methods,2017,240:26-31.

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