王相 范帥帥 馮玉 楊夢婷 李軍山 牛麗穎

摘要：目的? 制備女貞子飲片標(biāo)準(zhǔn)煎液，并進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。方法? 制備16批不同產(chǎn)地女貞子飲片標(biāo)準(zhǔn)煎液，以特女貞苷為定量檢測指標(biāo)，計(jì)算轉(zhuǎn)移率與出膏率，并建立其UPLC特征圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件進(jìn)行分析。結(jié)果? 16批女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液特女貞苷轉(zhuǎn)移率為33.57%～56.91%，出膏率為23.20%～26.87%。UPLC特征圖譜標(biāo)定了10個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中1個(gè)峰。16批女貞子飲片標(biāo)準(zhǔn)煎液相似度評價(jià)結(jié)果顯示其相似度均大于0.90。聚類分析將16批女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液分為2類;主成分分析提取出了3個(gè)主成分，其累積貢獻(xiàn)率達(dá)92.73%。結(jié)論? 本研究可為女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液及其配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：女貞子;標(biāo)準(zhǔn)煎液;轉(zhuǎn)移率;特征圖譜;主成分分析

中圖分類號：R284.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）07-0084-05

Abstract： Objective To prepare Ligustri Lucidi Fructus standard decoction; To study the quality standard. Methods Sixteen batches of Ligustri Lucidi Fructus standard decoction were prepared. With specnuezhenide as the detection index， the transfer rate and extractum rate were calculated and the UPLC characteristic chromatograms analysis method was established. Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to analyze and compare the characteristic chromatograms. Results The transfer rates of 16 batches of Ligustri Lucidi Fructus standard decoction ranged from 33.57% to 56.91%， and extractum rates were at the range of 23.20%–26.87%. Ten common peaks were determined and one was identified. The similarity evaluations were carried out on 16 batches of Ligustri Lucidi Fructus standard decoction， and their similarities were all greater than 0.90. 16 batches of Ligustri Lucidi Fructus standard decoction were divided into 2 categories according to hierarchical cluster analysis. 3 principal components were extracted by PCA， whose cumulative contribution rate was 92.73%. Conclusion The study and preparation of Ligustri Lucidi Fructus standard decoction can provide a reference for the quality control of Ligustri Lucidi Fructus formula granules.

Keywords： Ligustri Lucidi Fructus; standard decoction; transfer rate; characteristic chromatogram; PCA

女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ail.的干燥成熟果實(shí)。冬季果實(shí)成熟時(shí)采收，除去枝葉，稍蒸或置沸水中略燙后干燥，或直接干燥。女貞子味甘、苦，性涼，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)功效，用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目黯不明、內(nèi)熱消渴、骨蒸潮熱[1]。女貞子主要含有環(huán)烯醚萜苷類、三萜類、苯乙醇類、黃酮類、多糖類等成分，環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇類化合物是其重要的活性成分[2]，包括特女貞苷、橄欖苦苷、女貞苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷、紅景天苷、酪醇等?，F(xiàn)代藥理研究表明，女貞子具有免疫調(diào)節(jié)、強(qiáng)心、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、降血糖、保肝、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗炎抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)激素、促毛囊生長等作用[3]。

中藥配方顆粒作為一種新型中藥飲片形式，具有積極的臨床意義和實(shí)用價(jià)值，是中藥發(fā)展的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，但目前仍存在標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、制備工藝不完善等問題。為解決中藥配方顆粒發(fā)展所面臨的多種問題，國家藥典委員會(huì)2016年發(fā)布了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》，該技術(shù)要求明確提出將標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是指以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，選取道地藥材或主產(chǎn)區(qū)藥材，經(jīng)加工炮制成合格飲片后，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑[4]。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備遵循傳統(tǒng)湯劑的煎煮原則，整個(gè)流程具有標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化的特點(diǎn)，能夠保證工藝的統(tǒng)一，進(jìn)而保障其質(zhì)量的穩(wěn)定和統(tǒng)一，提高臨床用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性。本研究選用主產(chǎn)區(qū)符合規(guī)范的16批女貞子飲片制備標(biāo)準(zhǔn)煎液，以特女貞苷為指標(biāo)成分，測定其含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率和出膏率范圍，并進(jìn)行特征圖譜研究，為女貞子飲片標(biāo)準(zhǔn)煎液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，同時(shí)提高女貞子配方顆粒的質(zhì)量控制水平。

1? 儀器與試藥

ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)（PDA檢測器），美國沃特世公司;Empower3色譜工作站，美國沃特世公司;LC-15C高效液相色譜儀，日本島津公司;Pilot5-8L真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;BSA224S-CW電子分析天平，北京賽多利斯;JY10001型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;KQ-250型超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司;RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;BJH-W200F型陶瓷自動(dòng)中藥煲（電源220 V、50 Hz，功率300 W，容量3.0 L），廣東天際電器股份有限公司。

特女貞苷對照品（批號111926-201605，純度93.3%），中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈，F(xiàn)isher化學(xué)試劑公司;磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。16批不同來源女貞子飲片均由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，樣品信息見表1。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備

取女貞子飲片100 g，煎煮2次。一煎加8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸60 min;二煎加6倍量水，武火煮沸，文火保持微沸40 min。趁熱用120目篩網(wǎng)過濾，合并2次煎液，迅速冷卻。55 ℃真空減壓濃縮至密度為1.01～1.06時(shí)，冷凍干燥，得干膏粉，即標(biāo)準(zhǔn)煎液干燥粉末，計(jì)算出膏率，測定水分[5]，結(jié)果出膏率為23.20%～26.87%，見表2。

2.2? 特女貞苷含量測定

2.2.1? 色譜條件

色譜柱：Wondasil C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸為流動(dòng)相B，甲醇為流動(dòng)相C，按表3進(jìn)行梯度洗脫;流速：1.0 mL/min;檢測波長：224 nm;進(jìn)樣量：10 ?L。女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液色譜圖見圖1。

2.2.2? 對照品溶液的制備

精密稱取特女貞苷對照品適量，加稀乙醇制成每l mL含0.102 4 mg特女貞苷的溶液，即得。

2.2.3? 供試品溶液的制備

取干膏粉適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，放冷，用稀乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.2.4? 方法學(xué)考察

2.2.4.1? 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液2、4、8、12、16、20 ?L，按上述色譜條件測定。以特女貞苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果特女貞苷在0.219 5～2.195 1 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1.051 1×106X-4.233 9×104，r=0.999 7。

2.2.4.2? 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液10 ?L，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得特女貞苷含量RSD=1.86%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取干膏粉約0.1 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 ?L，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣測定，計(jì)算得特女貞苷含量RSD=0.86%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.4? 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取干膏粉6份，每份約0.1 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 ?L，按上述色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算得特女貞苷含量RSD=0.42%，表明本法重復(fù)性良好。

2.2.4.5? 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批干膏粉6份，每份約0.05 g，精密稱定。設(shè)高、中、低濃度組，分別按1∶0.8、1∶1、1∶1.2精密加入一定體積的特女貞苷對照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算平均回收率為102.7%。

2.2.5? 樣品測定

采用上述色譜條件測定16批女貞子飲片和標(biāo)準(zhǔn)煎液中特女貞苷的含量和轉(zhuǎn)移率，結(jié)果特女貞苷轉(zhuǎn)移率為33.57%～56.91%，見表4。

2.3? 特征圖譜的建立與評價(jià)

2.3.1? 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m）;流動(dòng)相：0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，97%～95%A;3～5 min，95%～92%A;5～7 min，92%～90%A;7～9 min，90%～88%A;9～11 min，88%～86%A;11～13 min，86%～84%A;13～15 min，84%～82%A;15～17 min，82%～80%A;17～19 min，80%～78 %A;19～21 min，78%～75%A;21～23 min，75%～70%A;23～26 min，70%A）;流速：0.3 mL/min;檢測波長：224 nm;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：1 ?L。在此色譜條件下，各色譜峰與相鄰峰的分離度良好，峰形對稱。UPLC特征圖譜見圖2、圖3。

2.3.2? 對照品溶液的制備

精密稱取特女貞苷對照品適量，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，配制成每1 mL含0.075 mg特女貞苷的對照品溶液。

2.3.3? 供試品溶液的制備

取干膏粉適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，放冷，用稀乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.3.4? 方法學(xué)考察

通過與對照品色譜圖比對，指認(rèn)8號峰為特女貞苷，選擇該峰為參照峰，計(jì)算女貞子飲片、標(biāo)準(zhǔn)煎液中主要特征峰的相對保留時(shí)間、相對峰面積。

2.3.4.1? 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于3%，符合特征圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣分析，記錄各峰的峰面積。計(jì)算得各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4.3? 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批樣品各約0.1 g，按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并記錄峰面積，計(jì)算共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于3%，表明本法重復(fù)性良好。

2.3.5? 特征圖譜的建立

分別制備16批女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對色譜圖進(jìn)行匹配，得到特征圖譜。女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液確定了10個(gè)共有峰，根據(jù)色譜峰匹配結(jié)果進(jìn)行相似度分析，16批標(biāo)準(zhǔn)煎液與對照圖譜的相似度均大于0.9，符合指紋圖譜相似度要求。

2.4? 主成分分析

依據(jù)16批女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液特征圖譜，選擇10個(gè)共有峰作為分析變量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果3個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到92.734%，代表了10個(gè)分析變量的大部分信息。其中第1主成分的貢獻(xiàn)率最大（57.701%），其次為第2主成分（29.193%）。第1主成分中變量值權(quán)重大者分別為峰4、5、8、9、10號峰，與特征圖譜峰面積占比相當(dāng)。可將16批樣品分為2類，Ⅰ類包括河南、山西、四川、浙江、湖北產(chǎn)區(qū)樣品，Ⅱ類包括安徽產(chǎn)區(qū)樣品。結(jié)果見表5、圖4。

2.5? 聚類分析

對16批女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液共有峰峰面積采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖5。可見，當(dāng)歐式距離為15時(shí)，16批女貞子樣品可聚為2類，Ⅰ類包括河南、山西、四川、浙江產(chǎn)區(qū)樣品，Ⅱ類包括湖北、安徽產(chǎn)區(qū)樣品。與主成分分析結(jié)果基本一致，同時(shí)也說明女貞子產(chǎn)地不同對其質(zhì)量稍有影響。

3? 討論

女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液的工藝研究中，發(fā)現(xiàn)飲片粉碎粒度對出膏率的影響較大，而對特女貞苷含量影響較小，因此在制備過程中，選擇機(jī)械碾壓破壁即可，無需粉碎，可為后續(xù)生產(chǎn)提供方便。

女貞子含量測定多以脂溶性成分為主[6-7]，而女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液為純水提取，該類成分在標(biāo)準(zhǔn)煎液中未檢出或含量太低而不能定量或指認(rèn)，因此選擇指認(rèn)特女貞苷峰。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有一含量較高且峰形完整、分離度較好的峰，但未能指認(rèn)，有待進(jìn)一步研究。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，采用2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）女貞子項(xiàng)下含量測定方法，特女貞苷峰有拖尾，進(jìn)行調(diào)整后未能分開，經(jīng)摸索，以甲醇-乙腈-磷酸水溶液三相為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，特女貞苷峰分離度高且無拖尾，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均良好，故采用三相洗脫用于女貞子標(biāo)準(zhǔn)煎液含量測定。

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