易麗娟 鄒蘇蘭 柳蘭 李雅 郭紫妍

摘要：目的? 優(yōu)化益氣活血方醇提工藝參數。方法? 采用G1-熵權法和響應面設計，在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數、乙醇用量、提取時間為考察因素，黃芪甲苷和丹參酮類成分的轉移率及浸膏得率為評價指標，優(yōu)選益氣活血方醇提最佳工藝參數。結果? 最佳醇提工藝參數為：用70%乙醇提取2次，第1次用8倍量乙醇提取120 min，第2次用6倍量乙醇提取90 min。3次平行驗證試驗平均綜合評分為95.79，RSD=0.74%。結論? 優(yōu)選出的益氣活血方醇提最佳工藝穩(wěn)定可行，可為益氣活血方的新藥開發(fā)提供依據。

關鍵詞：益氣活血方;醇提工藝;G1-熵權法;響應面設計;黃芪甲苷;丹參酮類成分

中圖分類號：R283.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）07-0073-06

Abstract： Objective To optimize the technological parameters of ethanol extraction of Yiqi Huoxue Prescription. Methods Using G1-entropy method and response surface design， based on the single factor experiment， the volume fraction of ethanol， the amount of ethanol and the extraction time were taken as the evaluation factors. Extract yield and the transfer rate of astragaloside Ⅳ and tanshinones were evaluation indexes. The technological parameters of ethanol extraction of Yiqi Huoxue Prescription was optimized. Results The optimal technological parameters of ethanol extraction were extracted twice with 70% ethanol; the first ethanol dosage was 8 times， the extraction time was 120 min; the second ethanol dosage was 6 times， and the extraction time was 90 min. The average score of the three parallel validation tests was 95.79 and the RSD was 0.74%. Conclusion The optimal process of ethanol extraction of Yiqi Huoxue Prescription is stable and feasible， which can provide references for development of new medicine of Yiqi Huoxue Prescription.

Keywords： Yiqi Huoxue Prescription; ethanol extraction process; G1-entropy method; response surface design; astragaloside Ⅳ; tanshinones

益氣活血方是湖南中醫(yī)藥大學郭志華教授依據中醫(yī)理論結合多年臨床經驗，運用益氣活血、利水消腫中藥組方而成，用于治療心氣虧虛、血瘀水停型心衰患者[1-2]。方中以黃芪為君藥，丹參和紅花均為臣藥，佐以人參、澤瀉及豬苓等。研究表明，黃芪抗心衰的主要活性成分為黃芪甲苷，其對心肌細胞損傷有抗凋亡作用[3-5]。丹參中的脂溶性丹參酮類具有抗動脈粥樣硬化、保護心臟等作用[6-7]。這兩類主要藥效成分醇提得率普遍高于水提，故采取醇提方式對益氣活血方中脂溶性藥效成分進行提取工藝研究。為避免單一指標考察的片面性，本研究選取方中主要藥效成分及浸膏得率為綜合考察指標，并采用基于G1法和熵權法的組合賦權法[8]與響應面設計[9]優(yōu)選合理、可行的益氣活血方醇提工藝條件參數，為益氣活血方的后期研究及新藥開發(fā)提供依據。

1? 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（配置DAD檢測器），安捷倫公司;Allteeh E1803300蒸發(fā)光檢測器，天津埃文森科技有限公司;DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司;CP114電子天平，奧豪斯儀器有限公司。

藥物飲片購于湖南省昌都振興中藥飲片實業(yè)有限公司，經湖南中醫(yī)藥大學龔力民副教授鑒定，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定。黃芪甲苷對照品（批號110781-201717，質量分數96.9%）、丹參酮ⅡA對照品（批號110766-201721，質量分數99.5%），中國食品藥品檢定研究院;水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2? 方法與結果

2.1? 益氣活血方醇提液的制備

稱取益氣活血方醇提藥物飲片120.0 g（黃芪45.0 g、丹參22.5 g等），分別以不同醇提工藝條件進行加熱回流提取，過濾，濾液備用，即得。

2.2? 黃芪甲苷轉移率測定

2.2.1? 色譜條件

色譜柱為Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動相為乙腈-水（36∶64），流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃。ELSD參數：漂移溫度60 ℃，載氣流速1.5 L/min，增益4。理論塔板數按黃芪甲苷峰計算均不低于4000。

2.2.2? 對照品溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷對照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得0.5 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液。

2.2.3? 黃芪供試品溶液的制備

精密稱取黃芪中粉4.003 7 g，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內徑1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，0.45 ?m微孔濾膜過濾，即得[10]。

2.2.4? 益氣活血方醇提供試品溶液的制備

精密吸取按“2.1”項下方法制備的益氣活血方醇提液100 mL，水浴蒸干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次30 mL，合并正丁醇萃取液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，再用蒸餾水30 mL洗滌1次，棄去水層，正丁醇液置水浴上蒸至近干，殘渣加甲醇溶解后定容至5 mL容量瓶中，搖勻，0.45 ?m微孔濾膜過濾，即得[11-12]。

2.2.5? 陰性對照溶液的制備

取不含黃芪的益氣活血方藥物飲片，按“2.2.4”項下方法制備，即得。

2.2.6? 專屬性試驗

精密吸取上述對照品溶液、益氣活血方醇提供試品溶液和陰性對照溶液各10 ?L，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結果見圖1。陰性對照溶液色譜圖中未見黃芪甲苷色譜峰，表明陰性無干擾。

2.2.7? 線性關系考察

精密吸取黃芪甲苷對照品溶液1、5、10、15、20、25 ?L，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以進樣量的自然對數為橫坐標，以對照品峰面積的自然對數為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=1.479X+17.363（r2=0.992），表明黃芪甲苷在0.49～12.11 ?g范圍內線性關系良好。

2.2.8? 精密度試驗

精密吸取黃芪甲苷對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，每次10 ?L，黃芪甲苷峰面積RSD=1.24%，表明儀器精密度良好。

2.2.9? 重復性試驗

取同一醇提工藝條件的益氣活血方醇提液，按“2.2.4”項下方法制備6份供試品溶液，分別按“2.2.1”項下色譜條件進樣，結果黃芪甲苷含量RSD=0.79 %，表明方法重復性良好。

2.2.10? 穩(wěn)定性試驗

取同一益氣活血方醇提供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，于0、3、6、9、12、24 h測定，結果黃芪甲苷含量RSD=1.20%，表明益氣活血方醇提供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.2.11? 加樣回收率試驗

取已知黃芪甲苷含量的益氣活血方醇提供試品溶液6份，每份1 mL，精密加入黃芪甲苷對照品0.2 mg，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算得黃芪甲苷平均加樣回收率為96.74%，RSD=1.68%，表明本法準確性良好。

2.2.12? 黃芪甲苷轉移率的計算

分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10、20 ?L，及黃芪供試品溶液和益氣活血方醇提供試品溶液各10 ?L，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用外標兩點法分別計算黃芪中黃芪甲苷含量（M0）和益氣活血方醇提液中黃芪甲苷含量（M），并計算益氣活血方醇提液中黃芪甲苷的轉移率（y1）。y1=M/M0 ×100%。

2.3? 丹參酮類轉移率測定

2.3.1? 色譜條件

色譜柱為Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動相A為乙腈，B為0.02%磷酸溶液，按表1進行梯度洗脫;柱溫20 ℃;檢測波長270 nm。理論板數按丹參酮ⅡA峰計算均不低于60 000。

2.3.2? 對照品溶液的制備

精密稱取丹參酮ⅡA對照品1.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，即得濃度為20 ?g/mL的丹參酮ⅡA對照品溶液。

2.3.3? 丹參供試品溶液的制備

精密稱取丹參粉末（過3號篩）0.300 5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得[10]。

2.3.4? 陰性對照溶液的制備

取不含丹參的益氣活血方藥物飲片，按“2.1”項下方法制備，即得。

2.3.5? 專屬性試驗

精密吸取丹參酮ⅡA對照品溶液、益氣活血方醇提供試品溶液和陰性對照溶液各10 ?L，按“2.3.1”項下色譜條件測定，以丹參酮ⅡA對照品為參照，以其相應的峰為S峰，計算隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的相對保留時間。結果見圖2。陰性對照溶液色譜圖中未見丹參酮類色譜峰，表明陰性無干擾。

2.3.6? 線性關系考察

精密吸取100 ?g/mL丹參酮ⅡA對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，分別精密吸取10 ?L，按“2.3.1”項下色譜條件測定，以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行回歸，得回歸方程Y=37.447X+21.943（r2=0.999 1），表明丹參酮ⅡA在10～100 ?g/mL范圍內線性關系良好。

2.3.7? 精密度試驗

精密吸取丹參酮ⅡA對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件重復進樣6次，每次10 ?L，丹參酮ⅡA峰面積RSD=0.73%，表明儀器精密度良好。

2.3.8? 重復性試驗

取同一醇提工藝條件的益氣活血方醇提液，分別按“2.3.1”項下色譜條件進樣，結果丹參酮ⅡA峰面積RSD=1.09%，表明方法重復性良好。

2.3.9? 穩(wěn)定性試驗

取同一醇提工藝條件的益氣活血方醇提液，按“2.3.1”項下色譜條件，于0、3、6、9、12、24 h測定，結果丹參酮ⅡA峰面積RSD=0.77%，表明益氣活血方醇提液在24 h內穩(wěn)定。

2.3.10? 加樣回收率試驗

取已知丹參酮ⅡA含量的益氣活血方醇提液6份，每份10 mL，精密加入丹參酮ⅡA對照品0.6 mg，按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算得丹參酮ⅡA的平均加樣回收率為97.54%，RSD=1.01%，表明本法準確性良好。

2.3.11? 丹參酮類轉移率的計算

精密吸取丹參酮ⅡA對照品溶液、丹參供試品溶液和益氣活血方醇提供試品溶液各10 ?L，按“2.3.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，分別計算丹參中丹參酮類總含量（N0）和益氣活血方醇提液中丹參酮類總含量（N），并計算益氣活血方醇提液中丹參酮類的轉移率（y2）。y2=N/N0×100%。

2.4? 浸膏得率測定

精密吸取“2.1”項下益氣活血方醇提液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃真空干燥3 h，置干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱重，計算浸膏得率（y3）。y3=殘渣質量×提取液總體積÷（移取供試液體積×提取藥物飲片總質量）×100%。

2.5? 多指標組合賦權

2.5.1? G1賦權法

G1賦權法是在層次分析法（AHP）基礎上改進的一種主觀賦權法，較AHP具有計算速度快、無需一致性檢驗的優(yōu)點[13]。依據益氣活血方配伍原則和功效相關藥效物質，確定益氣活血方醇提工藝3個評價指標的順序為y1>y2>y3，且相鄰指標的權重評價標度為r2（y1與y2）=1.2，r3（y2與y3）=1.6，按公式（1）（2）計算指標的權重系數wk。

2.5.2? 信息熵權法

信息熵權法是一種根據各指標原始數據所提供信息量的大小來確定各指標權重的客觀賦權法[14]。該指標的原始數據差異越大，其熵值越小，提供的信息量就越大，其在綜合評價中所起的作用也越大，即所占權重就越大，反之，其所占權重就越小[15-16]。采用EvaGear1.1.6820軟件分別計算益氣活血方醇提工藝3個評價指標的權重系數wh。

2.5.3? 組合權重的確定

設由G1賦權法得到的主觀權重為w1，信息熵權法得到的客觀權重為w2，按公式（3）計算指標的組合權重w[17]。

2.6? 提取次數考察

稱取益氣活血方醇提藥物飲片共120 g，第1次以7倍量70%乙醇提取90 min，第2次以5倍量70%乙醇提取60 min，第3次以5倍量70%乙醇提取60 min，分別測定各次提取的黃芪甲苷轉移率、丹參酮類轉移率及浸膏得率。結果表明，3個指標第3次提取占總提取比例分別為4.39%、4.25%和11.33%，因黃芪甲苷和丹參酮類轉移率為重要指標，且第3次提取占總提取比例均小于10%，故最終確定提取次數為2次。

2.7? 響應面試驗及結果分析

2.7.1? 響應面試驗設計

在預試驗和單因素試驗基礎上，選取乙醇體積分數（A）、乙醇用量（B）、提取時間（C）為自變量，每個自變量按低、中、高水平進行-1、0、1編碼，以綜合評分（Y）為響應值，進行三因素三水平Box-Behnken設計，因素水平見表2。

2.7.2? 響應面試驗結果與分析

采用多指標賦權法得到益氣活血方醇提各指標的組合權重，并按公式（4）計算各試驗條件的指標綜合評分P。益氣活血方醇提工藝各評價指標組合權重見表3，試驗結果見表4。采用Design-Expert10.0.7軟件對表4數據進行分析，擬合得到自變量A、B、C與響應值Y之間的二次多項回歸方程Y=130.19-4.33A-0.078B-0.28C+0.16AB+5.93×10-3AC+3.56×10-3BC+0.03A2-0.26B2-1.08×10-4C2。對上述回歸模型進行顯著性檢驗，結果見表5。

2.7.3? 響應面預測與工藝驗證

采用Design-Expert10.0.7軟件與Box-behnken設計-響應面法預測的最佳工藝參數為乙醇體積分數70%、乙醇用量14倍（8倍和6倍）、提取時間210 min（120 min和90 min），綜合評分為97.69。進行3次平行驗證試驗，結果見表6，平均綜合評分為95.79，RSD=0.74%，與預測值相差不大，且穩(wěn)定，表明該提取工藝穩(wěn)定可靠。

3? 討論

本研究中黃芪甲苷轉移率測定時益氣活血方醇提供試品溶液制備采用水飽和正丁醇萃取和氨試液洗滌的前處理方法。有文獻報道萃取時間和次數、堿洗時間和次數，以及每次萃取和堿洗所用的水飽和正丁醇和氨試液對黃芪甲苷含量測定結果均有影響，尤其氨試液洗滌是很關鍵的一步[18]。故水飽和的正丁醇萃取和氨試液洗滌不完全充分可能是本研究中黃芪甲苷轉移率偏低的原因。

中藥復方成分復雜，采用單一指標評價復方的內在質量具有極大的片面性，因此，本研究依據益氣活血方配伍原則和功效相關藥效物質，選擇黃芪甲苷轉移率、丹參酮類轉移率和浸膏得率3個指標作為益氣活血方醇提工藝的評價指標，能夠較合理地優(yōu)選出其最佳工藝參數。

多指標評價中藥復方提取工藝時最關鍵是權重系數的確定，目前主要有主觀賦權和客觀賦權兩大類確定權重的方法。G1賦權法是在AHP基礎上改進的一種主觀賦權法，信息熵權法是一種根據各指標原始數據所提供信息量的大小而確定各指標權重的客觀賦權法。本研究采用G1法和熵權法的組合賦權，既可避免主觀隨意性，又可增強各指標的內在聯(lián)系，使益氣活血方醇提工藝的多指標綜合評價結果更加合理，同時結合響應面設計將各因素和各指標的綜合評分函數化，能簡單準確地對益氣活血方醇提工藝參數進行優(yōu)選。

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