石娟娟 張欣 吳鳳萍 王沐淇 李亞萍 王文俊 高寧 黨雙鎖

PHB1是一種進(jìn)化上保守的膜蛋白，主要參與抑制細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等諸多細(xì)胞生命活動(dòng)[1-3]。越來越多的研究證實(shí)PHB1是肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中的異常表達(dá)蛋白之一，其與慢性丙型肝炎、酒精性肝病、肝腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞比較，PHB1在三個(gè)不同的人肝腫瘤細(xì)胞株Huh7、HepG2和SMMC-7721中低表達(dá)，在肝癌組織及癌旁組織中表達(dá)也顯著下調(diào)[7]。本研究通過檢測(cè)PHB1異常表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的影響，初步闡明PHB1影響HCC細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑

二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2×105個(gè)/孔濃度接種于六孔板，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞融合達(dá)70%～80%。根據(jù)PHB1的表達(dá)不同，實(shí)驗(yàn)分為PHB1高表達(dá)組和PHB1低表達(dá)組。其中，PHB1高表達(dá)組又分為pEGFP-PHB1轉(zhuǎn)染組、pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)染組(vector)和未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組(control)；PHB1低表達(dá)組分為shRNA-PHB1轉(zhuǎn)染組、shRNA-control空載轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組(control)。參照InvitrogentTM DMRIE-C Reagent說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，每500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋10 μL DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑和2 μg DNA，分別將兩者吹打混勻，放置于室溫30 min，以形成DNA/DMRIE-C轉(zhuǎn)染復(fù)合物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別將DNA/DMRIE-C復(fù)合物加入六孔板中，輕輕吹打混勻，培養(yǎng)箱孵育4 h，更換為DMEM完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組，僅不加DNA/DMRIE-C復(fù)合物，其余步驟均與上述相同。引物設(shè)計(jì)依照Genbank中PHB1(NM_002634.2)為模板，上游引物：5′-TGGGAGGTC-TATATAAGCAGAG-3′，下游引物：5′-CGTCGCC-GTCCAGCTCGACCAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度819 bp。shRNA-PHB1質(zhì)粒靶點(diǎn)序列為5′-GTAGCAAAGA-TTTACAGAA-3′；shRNA-control質(zhì)粒靶點(diǎn)序列為5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，鑒定pEGFP-PHB1和shRNA-PHB1質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染成功。

三、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)

取生長(zhǎng)旺盛和呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，將細(xì)胞重懸液以6×103個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板中，按照上述實(shí)驗(yàn)分組和轉(zhuǎn)染方法處理細(xì)胞，其中每孔加DNA 100 ng和DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑0.5 μL。繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48和72 h后棄上清，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h后每孔中加入150 μL DMSO，在酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定各孔的吸光度值(A)。存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)PHB1對(duì)人肝癌細(xì)胞周期的影響

取對(duì)數(shù)期的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞以6×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，用冷PBS溶液洗兩遍，棄去上清液，緩慢加入70%冰乙醇4℃固定過夜，冷PBS溶液清洗細(xì)胞去除乙醇，再加入含1% RNase A的Tris-HCl緩沖液(10 mmol Tris-HCl，pH 7.5)共同孵育15 min，PI染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并用ModFit LT2.0 軟件分析細(xì)胞周期分布。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

五、熒光定量PCR

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，冰上配制反應(yīng)體系25 μL [SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ(2×) 12.5 μL、正向引物 (20 μmol) 1 μL、反向引物 (20 μmol) 1 μL、cDNA模板2 μL、滅菌ddH2O 8.5 μL]；實(shí)時(shí)PCR條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。反應(yīng)結(jié)果由Sequence Detector System軟件分析，實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增的結(jié)果以Ct值表示。目的基因mRNA表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析經(jīng)過內(nèi)參GAPDH校正以及數(shù)據(jù)的線性轉(zhuǎn)換，相比對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)為2-△△Ct。引物設(shè)計(jì)見表1。

六、免疫印跡分析

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白；BCA法測(cè)定總蛋白含量；根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的濃度的SDS-PAGE凝膠電泳；電轉(zhuǎn)至PVDF膜；采用5%胎牛血清封閉1 h；然后加入一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗滌5 min，重復(fù)3次；再加二抗室溫孵育1 h；TBST洗滌5 min，重復(fù)6次；ECL發(fā)光顯影，放置G:BOX機(jī)器中5 min后，進(jìn)行照相。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PHB1高表達(dá)和低表達(dá)人肝癌細(xì)胞株

PHB1高表達(dá)(pEGFP-PHB1)和低表達(dá)質(zhì)粒(shRNA-PHB1)分別轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞48 h后，pEGFP-PHB1/N1及shRNA-PHB1/control轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中均可見明亮的綠色熒光，且pEGFP-PHB1和shRNA-PHB1轉(zhuǎn)染組的綠色熒光強(qiáng)度分別稍高于對(duì)照組pEGFP- N1和shRNA-control轉(zhuǎn)染組，而空白對(duì)照組未見綠色熒光，提示成功構(gòu)建PHB1高表達(dá)和低表達(dá)人肝癌細(xì)胞株。見圖1。

二、PHB1對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的影響

pEGFP-PHB1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，PHB1轉(zhuǎn)染組分別與vector轉(zhuǎn)染組、control組比較，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，并呈時(shí)間依賴性(P<0.01)；而vector組與control組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

shRNA-PHB1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，shRNA-PHB1轉(zhuǎn)染組分別與shRNA-control轉(zhuǎn)染組、control組比較，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)均有不同程度的促進(jìn)作用，并呈時(shí)間依賴性(P<0.01)；而shRNA-control組與control組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇pEGFP-PHB1和shRNA-PHB1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞48 h進(jìn)行后續(xù)研究。

三、PHB1對(duì)人肝癌細(xì)胞周期的影響

pEGFP-PHB1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，PHB1轉(zhuǎn)染組分別與vector轉(zhuǎn)染組、control組比較，G0/G1期細(xì)胞比例升高(P<0.01)，S期細(xì)胞比例下降(P<0.01)，而vector組與control組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；即高表達(dá)PHB1可阻滯細(xì)胞于G0/G1期，使S期比例下降，抑制細(xì)胞增殖。見表3。

shRNA-PHB1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，shRNA-PHB1轉(zhuǎn)染組分別與shRNA-control轉(zhuǎn)染組、control組比較，G0/G1期細(xì)胞比例下降(P<0.01)，S期細(xì)胞比例升高(P<0.01)，而shRNA-control組與control組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；即低表達(dá)PHB1可促使細(xì)胞趨于S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。見表3。

表1 實(shí)時(shí)PCR引物序列

圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后熒光顯微鏡鑒定結(jié)果(×100)

組別HepG224 h48 h72 hSMMC-772124 h48 h72 hPHB1高表達(dá) control98.82±1.0597.78±1.6994.62±2.2398.63±1.9597.22±3.3693.76±2.96 vector97.77±1.4596.20±2.1293.70±2.5796.98±2.0895.87±2.5792.62±4.03 PHB174.05±4.8753.30±3.4647.80±3.1371.67±2.3252.77±3.2250.25±5.62 t1/P11.44/0.181.43/0.180.66/0.521.42/0.190.78/0.450.56/0.59 t2/P212.17/0.0028.31/0.0029.84/0.0021.77/0.0023.38/0.0016.78/0.00 t3/P311.42/0.0025.89/0.0027.78/0.0019.45/0.0025.61/0.0015.00/0.00PHB1低表達(dá) control98.80±1.7297.30±2.6997.51±2.9598.73±2.1197.68±2.8396.88±2.37 shRNA-control97.55±2.2896.90±0.9696.32±3.0199.12±2.1296.41±2.0494.78±2.53 shRNA-PHB1104.68±6.03121.43±5.10129.90±6.08105.27±5.82123.25±5.03131.50±5.20 t4/P41.07/0.310.34/0.740.70/0.500.31/0.760.89/0.401.48/0.17 t5/P52.30/0.0410.25/0.0011.74/0.002.59/0.0310.86/0.0014.84/0.00 t6/P62.71/0.0211.58/0.0012.13/0.002.43/0.0412.11/0.0015.55/0.00

注：t1/P1：control組與vector組比較；t2/P2：PHB1組與control組比較；t3/P3：PHB1組與vector組比較。t4/P4：control組與shRNA-control組比較；t5/P5：shRNA-PHB1組與control組比較；t6/P6：shRNA-PHB1組與shRNA-control組比較

表3 PHB1異常表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞周期影響(±s，%)

注：t1/P1：control組與vector組比較；t2/P2：PHB1組與control組比較；t3/P3：PHB1組與vector組比較。t4/P4：control組與shRNA-control組比較；t5/P5：shRNA-PHB1組與control組比較；t6/P6：shRNA-PHB1組與shRNA-control組比較

四、PHB1對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)分子的影響

pEGFP-PHB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，PHB1轉(zhuǎn)染組分別與vector轉(zhuǎn)染組、control組比較，周期調(diào)控相關(guān)分子p53和p21CIP1 mRNA表達(dá)水平顯著性升高(t=19.93、25.55，P<0.01；t=12.70、14.93，P<0.01)，Cyclin A2、Cyclin E1和CDK2 mRNA表達(dá)水平顯著性降低(t=8.79、10.53，P<0.01；t=9.32、16.01，P<0.01；t=12.70、20.17，P<0.01)；而vector組和control組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2A。其蛋白質(zhì)表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平相一致，見圖2B。pEGFP-PHB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞相似，見圖2。

圖2 PHB1高表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞周期相關(guān)分子的影響

shRNA-PHB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，shRNA-PHB1轉(zhuǎn)染組分別與shRNA-control轉(zhuǎn)染組、control組比較，周期調(diào)控相關(guān)分子p53和p21CIP1 mRNA表達(dá)水平顯著性降低(t=6.23、11.32，P<0.01；t=4.41、6.70，P<0.01)，而Cyclin A2、Cyclin E1和CDK2 mRNA表達(dá)水平顯著性升高(t= 11.50、11.60，P<0.01；t=9.77、9.79，P<0.01；t=7.29、7.40，P<0.01)；而vector組和control組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3A。其蛋白質(zhì)表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平相一致，見圖3B。pEGFP-PHB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞相似，見圖3。

討 論

目前，肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究主要集中于信號(hào)通路、非編碼RNA、異常表達(dá)蛋白、表觀遺傳修飾和染色質(zhì)重塑等領(lǐng)域[8-9]，而尋找異常表達(dá)蛋白并研究其功能是探索肝癌發(fā)病機(jī)制的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

近年來，越來越多的研究證實(shí)，PHB1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示，PHB1蛋白在Mat1a基因敲除的肝臟特異性Phb1 KO老鼠模型呈現(xiàn)出高表達(dá)，若將PHB1沉默后可引起顯著的肝臟損傷、肝纖維化和肝細(xì)胞癌[10]。在高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞MHCC97-H中，高表達(dá)的PHB1可以抑制細(xì)胞增殖并且促進(jìn)細(xì)胞的遷徙[11]。PHB1可以作為WNT信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過激活WNT-β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路誘導(dǎo)HCC的發(fā)生[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，高表達(dá)PHB1可以抑制細(xì)胞增殖，而低表達(dá)PHB1則可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間依賴性。高表達(dá)的PHB1可阻滯細(xì)胞于G0/G1期，使S期比例下降，抑制細(xì)胞增殖；低表達(dá)PHB1則得出相反的結(jié)果，可促使細(xì)胞趨于S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究顯示，在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中，PHB1基因沉默后可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，使G0/G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例升高[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，說明高表達(dá)的PHB1可以顯著抑制細(xì)胞增殖，并與調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)。

為了進(jìn)一步明確PHB1抑制肝癌細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制，本研究對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因素進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，pEGFP-PHB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞48 h后，PHB1轉(zhuǎn)染組分別與vector組、control組比較，周期調(diào)控相關(guān)分子p53、p21CIP1 mRNA和蛋白水平均顯著升高，而Cyclin A2、Cyclin E1、CDK2 mRNA和蛋白水平均顯著降低；提示高表達(dá)PHB1可以提高p53和p21CIP1的表達(dá)水平，降低Cyclin A2、Cyclin E1、CDK2的表達(dá)水平。然而，低表達(dá)的PHB1則得出相反的結(jié)果。研究證實(shí)，p53的活化不僅是預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，而且也是有效根除腫瘤的治療靶點(diǎn)?；罨膒53可以進(jìn)一步阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[14]。p53引起的細(xì)胞周期阻滯需要p21CIP1的轉(zhuǎn)錄，p21CIP1可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期[14-15]。已往研究顯示，抗腫瘤藥物rocaglamide(是一種中藥單體成份)可以選擇性的結(jié)合PHB1，并且進(jìn)一步下調(diào)cyclin D、Cyclin E1、CDK2、CDK4和CDK5的表達(dá)水平，這些均是G0/G1期的調(diào)控蛋白，最終將細(xì)胞阻滯于G0/G1期[16]，與本研究結(jié)果相似。

圖3 PHB1低表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞周期相關(guān)分子的影響

本研究初步證實(shí)了PHB1抗HCC細(xì)胞增殖作用可能與調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)，其作用機(jī)制可能是PHB1選擇性結(jié)合p53，進(jìn)而使p21CIP1表達(dá)水平升高，Cyclin A2、Cyclin E1、CDK2表達(dá)水平降低，最終達(dá)到調(diào)控細(xì)胞周期的目的。雖然本研究為PHB1抗增殖作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。但是，PHB1干擾HCC細(xì)胞周期更為確切的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。