徐永霞，尹一鳴，趙洪雷，李學鵬，朱文慧，李秋瑩，謝 晶，勵建榮,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

牙鲆（Paralichthys olivaceus）又稱比目魚、偏口等，廣泛分布于中國、日本沿海和朝鮮半島，是我國主要海水養(yǎng)殖魚類中的名貴經濟魚類[1]。其肉質細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者的喜愛。目前牙鲆魚主要是鮮活銷售，但由于魚肉富含高蛋白質和水分，且不飽和脂肪酸含量較高，極易受內源酶、微生物及脂肪氧化作用而發(fā)生腐敗變質[2-3]。據統(tǒng)計，我國水產品在貯藏、加工及流通過程中損失率高達15%，相當于發(fā)達國家平均損失率的3 倍，造成了我國水產資源的嚴重浪費[4]。

植物精油是一類新型生物保鮮劑，憑借其較強的抗菌和抗氧化活性，在水產品保鮮方面的應用越來越廣泛[3,5]。其中肉桂醛是一種醛類化合物，為黃色的黏稠狀液體，大量存在于肉桂、藿香以及桂皮等天然植物精油中，具有良好的抗氧化性和抑菌性，能夠有效抑制水產品中腐敗微生物的生長繁殖，延緩魚肉揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值的升高，對水產品的保鮮效果顯著[6-7]。Dong Zheng等將肉桂油應用于南美白對蝦的包裝中，利用其抗菌作用達到了良好的保鮮效果[8]。但是有些精油存在強烈的氣味，會影響水產品的感官接受性，所以在實際應用中要控制使用濃度或采用包埋技術進行掩蔽[3]。Lyu Fei等研究了γ射線輻射結合肉桂油對魚片品質的影響，發(fā)現兩者聯合使用具有協(xié)同增效的作用，因此在有效保持魚肉品質的同時可以降低輻射劑量和肉桂油濃度[7]。董志儉等通過微膠囊技術包埋姜黃油，發(fā)現將其運用到魚丸保鮮中，能有效減緩脂肪氧化，延長魚丸的保質期[9]。

超高壓是一種新型的冷殺菌技術，只作用于非共價鍵結構，不會破壞蛋白質的一級結構，通過改變大分子物質的高級結構實現瞬時、高效殺菌，能在一定程度上抑制脂肪水解，鈍化酶活力，延長食品的貨架期，并能很好地保持食品原有的色、香、味和營養(yǎng)成分[10]。近年來，超高壓技術在水產品貯藏與加工領域得到廣泛應用，主要集中在蝦、蟹、貝及魚類等的脫殼、貨架期延長、品質改良及快速冷凍和解凍方面[11]。但是由于微生物對壓力的敏感性不同，部分細菌對壓力有很強的耐受性，限制了超高壓技術在食品中的應用。因此，借助于柵欄效應，將抑菌劑與超高壓技術結合使用，可增強超高壓的殺菌效果，在較溫和的壓力條件下達到有效滅菌率[12]。有研究報道，超高壓與Nisin、6-姜酚等協(xié)同處理對微生物的抑制作用明顯加強，能破壞微生物的細胞膜，使保鮮劑易于滲入[13-14]。目前，國內外關于肉桂油或超高壓單獨處理對魚肉品質的影響均有報道，但關于兩者協(xié)同處理在魚肉保鮮方面的應用報道較少。鑒于此，本實驗以牙鲆為對象，研究了肉桂醛、超高壓及肉桂醛和超高壓協(xié)同處理對魚片4 ℃貯藏過程中品質變化的影響，以期為牙鲆魚低溫貯藏保鮮技術提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活牙鲆購于錦州市林西街水產市場，每尾質量為（800±100）g。

肉桂醛 深圳市國鑫香精香料有限公司；羥丙基-β-環(huán)糊精 河南華瑞生物科技股份有限公司；平板計數瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術有限責任公司；吐溫-80天津永晟精細化工有限公司；TBA、三氯乙酸、高氯酸上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HPP.L2-600/0.6超高壓設備 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；TA-XT plus型質構分析儀英國Stable Micro Systems公司；FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇景集團蘇州安泰技術有限公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；JHG-Q60-P100均質機 上海融合機械設備有限公司；Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Biofuge stratos臺式冷凍高速離心機 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 保鮮劑的制備

根據預實驗結果配制肉桂醛保鮮劑，保鮮劑包含0.2 g/100 mL肉桂醛、0.4 g/100 mL羥丙基-β-環(huán)糊精和2 g/100 mL吐溫-80。具體配制方法：稱取4 g羥丙基-β-環(huán)糊精，超聲溶解至澄清透明溶液，然后將2 g肉桂醛（經20 g吐溫-80溶解）加入其中，定容到1 000 mL后在50 ℃下超聲30 min，超聲功率200 W。

1.3.2 樣品處理

將新鮮的牙鲆魚運至實驗室，敲擊頭部致死，從魚脊背處均勻剖成兩片，去除魚皮，清洗瀝干后備用。將魚片隨機分成4 組，肉桂醛組魚片放入肉桂醛保鮮劑中浸泡30 min后瀝干，用無菌蒸煮袋密封；超高壓組魚片用無菌蒸煮袋密封，在200 MPa下保壓處理10 min；肉桂醛+超高壓組魚片放入肉桂醛保鮮劑中浸泡30 min，瀝干后用無菌蒸煮袋密封，在200 MPa下處理10 min；未處理樣品直接用無菌蒸煮袋密封為空白組。所有樣品均置于4 ℃冰箱貯藏，分別在第0、4、8、12、16、20天取樣，進行各項指標的測定。

1.3.3 菌落總數的測定

根據GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》，采用稀釋平板計數法測定菌落總數。

1.3.4 持水性的測定

參考趙宏強等[15]的方法并適當修改，將魚肉切成小塊后準確稱質量，記為m1/g；然后用濾紙包裹，放入離心管中，5 000 r/min離心9 min，瀝干表面水分后再次稱質量，記為m2/g。持水性按公式（1）進行計算。

1.3.5 TVB-N含量的測定

參照丹麥FOSS公司提供的方法[16]使用全自動定氮儀測定牙鲆魚肉中TVB-N含量。

1.3.6 TBA值的測定

TBA值的測定參考馬海建等[17]的方法并加以修改。稱取10 g絞碎魚肉于燒杯中，加入25 mL蒸餾水，均質后加入10 g/100 mL三氯乙酸25 mL，混勻后靜置30 min，過濾，取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，將混合液在80 ℃恒溫水浴鍋中加熱40 min，取出冷卻至室溫后在532 nm波長處測其吸光度。TBA值以每千克魚肉中所含丙二醛質量表示，單位為mg/kg。

1.3.7 K值的測定

K值的測定參考?zogul等[18]的方法并稍作修改，稱取5 g絞碎的魚肉，加入25 mL 0.6 mol/L的高氯酸，均質后在1 940×g條件下離心10 min，取上清液，用1 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH值至6.5～6.8。然后在相同條件下再離心10 min，取上清液，用0.45 μm的無機濾膜過濾后備用。K值的計算見公式（2）。

式中：ATP、AMP、ADP、IMP、Hx、HxR分別表示三磷酸腺苷、腺苷酸、二磷酸腺苷、肌苷酸、次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷的含量/（μmol/g）。

1.3.8 質構分析

將魚肉切成邊長為2 cm的正方體，使用質構分析儀TPA模式測定。設定參數為：測試前探頭下降速率2.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s，測試后探頭回程速率1.0 mm/s，樣品壓縮形變量為50%，觸發(fā)力值5 g，測定時間5 s，探頭類型P/50。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

所有數據至少為3 次平行實驗的平均值。采用Origin 9.0軟件作圖，SPSS 19.0軟件進行顯著性檢驗，多重比較采用Duncan's檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同處理對牙鲆魚片冷藏過程中菌落總數的影響

圖1 不同處理組牙鲆魚片冷藏過程中菌落總數的變化Fig. 1 Changes in total bacterial count in flounder fillets with different treatments during cold storage

菌落總數是用來判斷食品的污染程度及衛(wèi)生質量的有效指標，菌落總數能夠直觀地反映出食品的腐敗程度[19]。國際食品微生物標準委員會（International Commission of Microbiological Specializations on Food，ICMSF）規(guī)定魚肉中菌落總數超過6（lg（CFU/g））時即為腐敗變質。由圖1可以看出，不同處理組牙鲆魚片的菌落總數均隨著貯藏時間的延長而顯著增加（P＜0.05），其中空白組的增長速度明顯高于其他處理組（P＜0.05），貯藏12 d時空白組魚片的菌落總數達到6.22（lg（CFU/g）），超過了ICMSF規(guī)定的可食用標準；肉桂醛和超高壓單一處理組魚片菌落總數在貯藏過程中差異不顯著（P＞0.05），在16 d時分別達到6.18（lg（CFU/g））和6.22（lg（CFU/g）），而兩者協(xié)同處理組魚片中菌落總數增長速度最慢，在20 d時達到6.28（lg（CFU/g）），超過了可食用標準。因此空白組、肉桂醛處理組、超高壓單一處理組、兩者協(xié)同處理組的貨架期分別為12、16、16、20 d。由此可見，超高壓和肉桂醛協(xié)同處理具有一定的增效作用，可以增強對微生物生長繁殖的抑制能力，起到更好的保鮮效果，延長魚肉的貯藏期。肉桂醛具有一定的疏水性，可以使菌體細胞膜通透性增強，同時其中的醛基能夠與細菌中的蛋白質和酶作用，破壞細菌正常的生理代謝，從而達到抑菌效果[20]。微生物對壓力敏感，超高壓會損壞菌體細胞膜，致使內容物外漏，結構被破壞，同時膜蛋白、核糖體和細胞代謝等都會受到高壓的作用，從而抑制微生物的生物活性[10,21]。Amanatidou等[22]研究發(fā)現，冷藏過程中鮭魚肉中的嗜冷假單胞菌和腐敗假單胞菌對高壓處理最為敏感，在100 MPa下處理30 min即失活。Ojagh等[23]研究發(fā)現，鮭魚在300 MPa下保壓處理10 min后菌落總數減少5（lg（CFU/g））。超高壓與肉桂醛的抑菌機制主要為滅活細菌孢子，而這種結合作用可以提高滅活速率，增強滅菌效果，推進亞致死損傷菌群的過度增生[12]。

2.2 不同處理對牙鲆魚片冷藏過程中持水性的影響

持水性表示在一定外力作用下，食品束縛自身或外來水分的能力[24]。持水性越大，說明食品的保水性越好。如圖2所示，新鮮牙鲆魚肉的持水性為83.74%，隨著貯藏時間的延長，各組魚片的持水性總體呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。其中，肉桂醛處理組魚肉的持水性下降速度最慢，其次是肉桂醛和超高壓協(xié)同處理組，而超高壓處理組的持水性下降速度最快，且樣品的持水性均低于空白組。由此可見，超高壓處理會顯著降低魚肉的持水性。新鮮牙鲆的肌肉組織均勻，肌原纖維排列緊密，持水性強；貯藏過程中內源蛋白酶和微生物酶的作用導致蛋白質分解，魚肉肌纖維結構遭到破壞，一部分水不能通過毛細管作用存在于肌原纖維的間隙中，從而使肌肉的持水能力下降；而經過超高壓處理后，牙鲆肌肉中部分蛋白質發(fā)生變性，肌原纖維蛋白結構改變，從而改變蛋白質分子的持水能力。此外，超高壓處理能使肌原纖維間的空隙變大，因此加大了持水性的下降程度[15]。這與Lakshmanan等[25]研究冷藏鮭魚經超高壓處理后的持水性變化結果相似。而兩者協(xié)同組的持水性仍較好，可能是由于肉桂醛的存在，使得持水性下降速度較超高壓處理組更慢，貯藏20 d時持水性仍達65.81%。

2.3 不同處理對牙鲆魚片冷藏過程中TBA值的影響

魚肉中不飽和脂肪酸氧化酸敗是導致其腐敗變質的主要原因之一，TBA值是評定魚肉脂肪氧化程度的良好指標[26]。由圖3可知，魚肉樣品的初始TBA值為0.5 mg/kg，隨著貯藏時間的延長，各組的TBA值均顯著增加（P＜0.05），其中空白組TBA值增加的幅度明顯高于其他處理組（P＜0.05）。在貯藏16 d內，肉桂醛和超高壓單一處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。據報道，當TBA值達到2 mg/kg時，表明魚肉已開始腐敗[27]。第12天時，空白組魚肉樣品的TBA值達到1.91 mg/kg，已接近腐敗的程度，說明其脂肪氧化程度較嚴重。貯藏16 d時，經肉桂醛和超高壓處理組魚肉的TBA值分別為1.86、1.89 mg/kg，而兩者協(xié)同處理組TBA值在第20天時才達到2.01 mg/kg。由此可見，單獨使用肉桂醛或超高壓處理均能延緩魚肉脂肪氧化的速度，而兩者協(xié)同處理對脂肪氧化的抑制效果更好。由于肉桂醛中含烯醛式結構，具有較強的還原性，能有效清除氧及自由基等，從而可抑制魚肉的脂肪氧化[20]。有學者在對鯖魚的研究中發(fā)現，超高壓處理能夠抑制魚肉中游離脂肪酸的生成，降低脂肪氧化程度，抑制魚肉貯藏期間TBA值的增長速率；但壓力過高會導致肌紅蛋白等色素蛋白變性，釋放鐵等金屬離子，反而會促進脂肪氧化[28-29]。

圖3 不同處理組牙鲆魚片冷藏過程中TBA值的變化Fig. 3 Change in TBA value of flounder fillets with different treatments during cold storage

2.4 不同處理對牙鲆魚片冷藏過程中TVB-N含量的影響

TVB-N含量是評價魚類等水產品新鮮程度的重要指標，可反映魚肉蛋白質等含氮物質在酶及細菌作用下分解產生的氨及低級胺類含量[30]。根據GB 2733—2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》規(guī)定，牙鲆等海水魚的可食用標準為TVB-N含量不超過30 mg/100 g。如圖4所示，新鮮牙鲆魚肉的初始TVB-N含量為8.9 mg/100 g，屬一級鮮度標準，隨著貯藏時間的延長，空白組的TVB-N含量顯著增加（P＜0.05），而其他處理組魚肉的TVB-N含量在貯藏4 d后才顯著增加（P＜0.05）。其中，空白組樣品的TVB-N含量在12 d時達到29.76 mg/100 g，已接近可食用標準的限值，超高壓和肉桂醛單一處理組的TVB-N含量在第16天時分別為32.31、31.93 mg/100 g，而兩者協(xié)同處理組的TVB-N含量在第20天時超過規(guī)定的可食用限量值。這與菌落總數的變化結果一致。由此說明，肉桂醛和超高壓處理均能延緩魚肉樣品TVB-N含量的升高，因為肉桂醛處理能有效抑制細菌的生長，從而降低蛋白質的分解速度，減緩TVB-N含量的上升；超高壓處理能在一定程度上殺滅部分微生物并使酶失去活性，從而阻止了含氮物質的產生，抑制TVB-N含量的上升[15]；而超高壓與肉桂醛協(xié)同處理對延緩TVB-N含量的增加具有一定的增效作用。

圖4 不同處理組牙鲆魚片冷藏過程中TVB-N含量的變化Fig. 4 Change in TVB-N content of flounder fillets with different treatments during cold storage

2.5 不同處理對牙鲆魚片冷藏過程中K值的影響

K值是通過分析ATP及其關聯化合物含量之間的關系而得到的數值，是評價魚肉初期鮮度的指標。K值越大，魚的新鮮度越差。一般將K值小于20%時劃分為一級鮮度，可用于生食；20%～40%為二級鮮度，超過60%表明已開始腐敗。由圖5可知，新鮮牙鲆的K值為10.81%，屬于一級鮮度標準，隨著冷藏時間的延長，各組樣品的K值不斷增大（P＜0.05）。其中空白組的K值增長速率顯著高于其他處理組（P＜0.05），在貯藏12 d時K值高達65.16%，表明魚肉已開始腐??；肉桂醛和超高壓處理組在貯藏16 d時的K值分別達到67.23%和69.02%，而兩者協(xié)同處理組的K值上升速度最慢，在20 d時達到71%，魚肉也已經腐敗。因此，肉桂醛和超高壓處理均能抑制ATP的降解，因為肉桂醛能夠抑制內源5'-核苷酸酶的活性，進而降低肌苷酸的分解，保持魚肉的新鮮度[3]；而超高壓處理會導致蛋白質的變性，使酶失活，從而抑制ATP的分解[10]。此外，肉桂醛和超高壓單獨處理組的K值在貯藏過程中差異不顯著（P＞0.05），這與菌落總數、TBA值等指標的變化規(guī)律基本一致，而兩者協(xié)同處理具有增效作用，能更好地抑制ATP的分解。

圖5 不同處理組牙鲆魚片冷藏過程中K值的變化Fig. 5 Change in K value of flounder fillets with different treatments during cold storage

2.6 不同處理對牙鲆魚片冷藏過程中質構特性的影響

魚肉的質構特性主要與肌肉中蛋白質、脂肪及水分含量有關[31]。魚類死后由于內源酶和微生物的作用，肌肉蛋白質降解、脂肪氧化、水分喪失，最終導致魚肉質地變軟、失去彈性[32]。魚死后肌肉中ATP含量急劇下降，導致肌肉收縮變得僵硬，當ATP完全消耗后含量，肌肉僵硬結束，魚肉又開始變軟。不同處理組牙鲆魚片貯藏過程中質構特性（硬度、彈性、咀嚼度和回復性）的變化如表1所示。隨著貯藏時間的延長，各組魚肉樣品的彈性、咀嚼度和回復性均顯著下降（P＜0.05），同時空白組的硬度也顯著降低（P＜0.05），而處理組的硬度呈先增加后下降的趨勢。在20 d的貯藏期內，處理組樣品的變軟速度低于空白組，貯藏末期時空白組的硬度較最初下降了74.0%，而經200 MPa超高壓、肉桂醛及兩者協(xié)同處理的魚肉樣品硬度下降幅度明顯變小，其硬度分別下降了66.5%、54.3%和52.6%，明顯低于空白組；此外，彈性、咀嚼度和回復性隨貯藏時間延長均不斷下降，各組與空白組之間的比較與硬度相似。由于肉桂醛和超高壓處理均能在一定程度上抑制微生物的生長和酶的活性，延緩蛋白質的分解，降低脂肪氧化速度，從而改善魚肉的質構特性。因此，超高壓和肉桂醛處理均能有效減緩牙鲆魚肉冷藏過程中質構的劣變，且兩者協(xié)同處理效果更佳。

表1 不同處理組牙鲆魚片冷藏過程中質構特性的變化Table 1 Change in texture properties of flounder fillets with different treatments during cold storage

3 結 論

實驗結果表明，肉桂醛、超高壓以及肉桂醛-超高壓協(xié)同處理對牙鲆魚片的保鮮效果均優(yōu)于空白組，其中肉桂醛-超高壓協(xié)同處理的魚片持水性下降緩慢，細菌菌落總數、TVB-N含量、TBA值、K值均顯著低于肉桂醛和超高壓單獨處理組（P＜0.05），且肉桂醛-超高壓協(xié)同處理能有效減緩牙鲆魚片冷藏期間硬度、彈性、咀嚼度等質構特性的下降。綜合各指標可以得出，肉桂醛和超高壓復合處理具有協(xié)同保鮮效果，能有效抑制牙鲆魚片冷藏過程中微生物的生長，降低蛋白質降解和脂肪氧化程度，使其貨架期比空白組延長約8 d，比肉桂醛和超高壓單獨處理組延長4 d左右。