郎晨曉，羅 欣，朱立賢，張一敏，韓廣星，董鵬程,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系臨沂站，山東 臨沂 276000）

雙組分調(diào)控系統(tǒng)（two-component regulatory system，TCS）是細菌感知外界環(huán)境信號，并將信號分子傳導(dǎo)至菌體內(nèi)部，從而激發(fā)相應(yīng)調(diào)控機制的重要途徑，對于細菌在壓力條件下的存活具有重要意義。在食品加工過程中，細菌經(jīng)常面臨多種亞致死的壓力環(huán)境，如高滲透壓、酸性、低水分活度等，TCS能夠幫助細菌感知環(huán)境變化并及時啟動體內(nèi)應(yīng)對機制，最大程度地提高自身的存活能力，甚至產(chǎn)生高抗性菌株。這種“抗逆性”的提高有利于食源性致病菌克服食品加工過程中的柵欄因子，從而危害食品安全。

在食品工業(yè)中，酸作為保鮮劑、酸度調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑等已有近100 年的應(yīng)用歷史，有機酸作為一種廉價、低能耗、效能持久的消毒減菌劑，在宰后動物的胴體表面應(yīng)用廣泛[1]。隨著有機酸在屠宰企業(yè)的大范圍應(yīng)用，越來越多的耐酸菌株開始顯現(xiàn)，消毒減菌效果開始衰退，有機酸長期使用的安全性亟待評估。細菌耐酸性的變化涉及自身的本底耐酸能力、外界環(huán)境的感知、氨基酸代謝的調(diào)控、核酸修復(fù)功能的啟動、質(zhì)子泵外排、細胞膜脂肪酸組成的變更等多種生理生化反應(yīng)的協(xié)同運作[2]。其中，以雙組分調(diào)控為基礎(chǔ)的對酸性環(huán)境的感知和信號的傳遞是食品中致病微生物耐酸性動員的第一步[3]。本文以細菌耐酸性為主，綜述了TCS的結(jié)構(gòu)作用、信號識別及其在酸性壓力下提升細菌耐受能力的調(diào)控過程。

1 TCS的結(jié)構(gòu)組成與調(diào)控機制

TCS由1 個組氨酸蛋白激酶（histidine protein kinase，HK）和1 個反應(yīng)調(diào)控（response regulator，RR）蛋白組成。HK通常是一個跨膜感應(yīng)蛋白，結(jié)構(gòu)分為3 部分，有感知外界信號分子作用的感應(yīng)功能區(qū)、自身磷酸化的位點區(qū)（又稱二聚體功能區(qū)）以及ATP結(jié)合部位。而RR蛋白位于胞質(zhì)內(nèi)，結(jié)構(gòu)可分為相對保守的能結(jié)合磷酸基團的N端、高度可變并能特異性結(jié)合DNA序列的C端[4]。

TCS的作用機制如下：HK中感應(yīng)功能區(qū)的膜外配體識別到外界信號后，激活自身與ATP結(jié)合部位，并將ATP水解為ADP，而后ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到二聚體功能區(qū)，與組氨酸位點結(jié)合，發(fā)生自我磷酸化；隨后，磷酸化的HK與RR蛋白的N端作用，將磷酸基團轉(zhuǎn)移到N端的天冬氨酸殘基位點，并激活C端的效應(yīng)區(qū)，從而改變其構(gòu)象，暴露出DNA結(jié)合位點，再與靶細胞基因的啟動子序列進行特異性結(jié)合，進而調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的轉(zhuǎn)錄與合成[4-5]。

研究表明，微生物對壓力環(huán)境的耐受能力與多種TCS有關(guān)，以沙門氏菌（Salmonella）為例，利于自身適應(yīng)酸脅迫的PhoP/PhoQ、利于抵抗宿主抗菌肽的PmrA/PmrB和能提升高鹽耐受能力的OmpR/EnvZ等系統(tǒng)對復(fù)雜環(huán)境下菌株的生存均有重要意義[6-8]。

2 TCS的識別信號

2.1 酸性環(huán)境信號

酸性環(huán)境可以激發(fā)微生物的PmrA/PmrB、PhoP/PhoQ和EvgS/EvgA等TCS產(chǎn)生調(diào)節(jié)效應(yīng)[9-10]。研究表明，在pH值為3.1的條件下，大腸桿菌（Escherichia coli）中PhoP/PhoQ的缺失會導(dǎo)致由其調(diào)控的多種酸激蛋白的合成受阻，且PhoP/PhoQ缺陷菌株的耐酸能力低于正常菌株，說明PhoP/PhoQ系統(tǒng)對細菌的酸耐受能力有利[11]。此外，Soncini等[12]以沙門氏菌正常菌株與pmrA突變菌株為研究對象，以受PmrA/PmrB調(diào)控的下游基因pbgP的表達量為測量指標，觀察到pH值由7.7降至5.8時，正常菌株的pbgP基因表達顯著上調(diào)，而pmrA突變菌株變化不明顯，這表明細菌中的PmrA/PmrB系統(tǒng)可以響應(yīng)酸信號。EvgS/EvgA系統(tǒng)是一種可提高大腸桿菌細胞耐酸性的雙組分系統(tǒng)，Sen等[10]在研究EvgS/EvgA對于酸性環(huán)境（pH值為5.5～5.7）的感應(yīng)模型時，提出pH值應(yīng)答由跨膜蛋白EvgS二聚化的強度所調(diào)控。

H+既可以作為某一雙組分系統(tǒng)的直接信號，又可以通過級聯(lián)反應(yīng)激活更多雙組分系統(tǒng)，例如H+是PmrA/PmrB的直接識別信號[13]，又可以通過對PhoP/PhoQ的激活而間接活化PmrA/PmrB系統(tǒng)[9]。

H+與金屬離子可以聯(lián)合誘導(dǎo)TCS產(chǎn)生應(yīng)答。例如在H+存在的情況下，高濃度的Mg2+不能抑制PhoP/PhoQ的調(diào)控效應(yīng)[12]，但具體機制仍不明確。此外，在H+與金屬離子（如Mg2+信號）存在時細菌產(chǎn)生耐酸響應(yīng)，其機理是H+與PhoQ結(jié)合后通過PhoP調(diào)控下游基因，亦或是誘導(dǎo)其他系統(tǒng)產(chǎn)生協(xié)同作用仍待研究。

2.2 金屬離子信號

TCS的跨膜蛋白感應(yīng)到外界金屬離子信號后與之結(jié)合，將磷酸基團傳遞至胞內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，進而引起其構(gòu)象變化，產(chǎn)生調(diào)控效應(yīng)。以PhoP/PhoQ為例，當?shù)蜐舛鹊腗g2+（μmol級別）與PhoQ的結(jié)合位點結(jié)合時，會通過自身磷酸化激活PhoP蛋白，形成PhoP-P，從而調(diào)控耐酸因子、毒力因子等的表達。相反，濃度較高（mmol級別）的Mg2+會引起PhoP-P去磷酸化，抑制由PhoP/PhoQ激活的下游基因表達，例如減弱野生型沙門氏菌的毒力[14]。Véscovi等[6]用Ca2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Ba2+等代替Mg2+測定PhoP/PhoQ激活基因psiD的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)Ca2+、Mn2+同Mg2+對PhoP/PhoQ的激活作用類似，而其他離子不能被識別。對于PmrA/PmrB系統(tǒng)，W?sten等[7]提出Fe3+和Al3+都是沙門氏菌PmrA/PmrB系統(tǒng)的環(huán)境信號。而Zn2+對大腸桿菌PmrA調(diào)控的基因表達有誘導(dǎo)作用，但對沙門氏菌沒有影響[15]。

除上述金屬離子信號外，還有能被金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ArlR/ArlS識別的Zn2+和Mn2+[16]，能激發(fā)大腸桿菌HydH/HdyG作用的Pb2+[17]，能被志賀菌（Shigella）KdpD/KdpE系統(tǒng)響應(yīng)的K+[5]，能夠誘導(dǎo)大腸桿菌CusS/CusR系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答的Ag+和Cu2+[18]信號等。

2.3 滲透壓信號

TCS感應(yīng)到外界環(huán)境的滲透壓脅迫后，跨膜蛋白激酶發(fā)生磷酸化，并將磷酸基團傳至胞內(nèi)效應(yīng)蛋白，進而通過調(diào)控孔道蛋白的組成比例等途徑對滲透脅迫產(chǎn)生應(yīng)答。OmpR/EnvZ、ColR/ColS、MtrB/MtrA等系統(tǒng)均能響應(yīng)滲透壓信號[8,19-20]，其中有關(guān)OmpR/EnvZ的研究最多，ompR基因缺失會引起細菌膜孔道蛋白OmpC、OmpF的表達出現(xiàn)差異，這兩種蛋白的作用是控制小分子親水物質(zhì)通過被動擴散進入細胞[8]。在響應(yīng)滲透壓信號的過程中，HKEnvZ具有雙向功能，其感應(yīng)到高滲脅迫后發(fā)生自我磷酸化，磷酸基團傳至調(diào)控蛋白OmpR形成OmpR-P，激活OmpC的生成，并抑制OmpF表達；一旦滲透脅迫消失，EnvZ又能作為去磷酸酶使OmpR-P變?yōu)镺mpR，低滲透壓環(huán)境導(dǎo)致OmpR磷酸化水平降低，利于OmpF的表達[21-22]。細菌通過此過程影響外膜上OmpC和OmpF兩種蛋白的組成比例，幫助細菌適應(yīng)脅迫環(huán)境。此外，Huang Xinxiang等[23]發(fā)現(xiàn)沙門氏菌在高滲（NaCl濃度為300 mmol/L）應(yīng)激初期，TCS中的OmpR和PhoP表達同步上調(diào)，說明細菌面對外界高滲壓力時，可能存在OmpR/EnvZ與PhoP/PhoQ多個系統(tǒng)協(xié)同作用的現(xiàn)象。

2.4 群體密度信號

除上述信號分子外，群體密度信號也能被TCS識別，如金黃色葡萄球菌中的AgrC/AgrA系統(tǒng)屬于群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）調(diào)控系統(tǒng)，系統(tǒng)中的HK AgrC可以感應(yīng)到細菌密度信號是否達到閾值，并能通過RR蛋白AgrA調(diào)控細菌的毒力、耐藥性等，利于細菌在脅迫環(huán)境下的存活[24]。QS調(diào)控系統(tǒng)還與細菌的生物膜形成有關(guān)，例如金黃色葡萄球菌中，有LuxS蛋白酶催化合成的用于種間交流的自誘導(dǎo)物質(zhì)（autoinducer-2，AI-2），LuxS/AI-2系統(tǒng)通過TCS的KdpD/KdpE調(diào)節(jié)胞外多糖莢膜的產(chǎn)生，影響生物膜的形成[25]。此外，沙門氏菌中的QseB/QseC雙組分系統(tǒng)等也能夠調(diào)控QS，且可以進一步與菌株的動力、侵襲力及耐藥性等生理特性聯(lián)系[4]。

2.5 其他識別信號

細菌復(fù)雜的生存環(huán)境中還存在多種信號分子，并涉及多種TCS，如可以由折疊錯誤的蛋白質(zhì)及鹽離子濃度的改變激活的CpxR/CpxA系統(tǒng)[9]，可以感受氧濃度變化從而產(chǎn)生調(diào)控效應(yīng)的FixL/FixJ系統(tǒng)[4]，與氮吸收相關(guān)的NreB/NreC系統(tǒng)等[26]。

3 TCS的調(diào)控作用

3.1 雙組分系統(tǒng)對耐酸性的調(diào)控

面對食品加工過程造成的酸性環(huán)境，TCS可以通過直接調(diào)節(jié)下游的耐酸基因來增強細菌在酸中的存活能力，也可以動態(tài)調(diào)控細胞膜結(jié)構(gòu)、氨基酸代謝、質(zhì)子泵外排和啟動核酸修復(fù)機制等，令細菌獲得額外的耐酸能力，并使細菌產(chǎn)生誘導(dǎo)耐酸響應(yīng)（acid tolerance response，ATR）。ATR是指微生物在微酸條件下生存一段時間后所表現(xiàn)出來的對于致死量強酸攻擊的一種適應(yīng)性反應(yīng)，又稱作酸耐受應(yīng)答反應(yīng)[27]。細菌ATR的產(chǎn)生可以提高細菌對酸性消毒劑的抵抗能力，同時產(chǎn)生交叉保護，增強細菌耐熱、耐氧化等能力，使細菌不易被殺死，還可能提高菌株毒性，影響食品安全[9,27]。研究證明PhoP/PhoQ、OmpR/EnvZ、PmrA/PmrB、EvgS/EvgA等雙組分系統(tǒng)均與菌株誘導(dǎo)耐酸能力有關(guān)[10-12,28]。本文第4部分將著重介紹沙門氏菌、大腸桿菌等食品加工過程中常見微生物的雙組分系統(tǒng)對酸的響應(yīng)機制。

3.2 雙組分系統(tǒng)對毒力因子的調(diào)控

致病菌對宿主的致病性與其抵抗宿主抗菌肽的侵襲、在巨噬細胞中存活、自身毒素釋放等過程有關(guān)，且細菌毒力受自身的黏附力、侵襲力、毒素種類等影響，TCS作為調(diào)節(jié)蛋白，對細菌的致病過程及毒力均有調(diào)控作用[15,29]。Rodrigues等[30]用PhoP/PhoQ缺陷型沙門氏菌接種蛋雞，發(fā)現(xiàn)其肝臟和脾中細菌數(shù)量較正常菌株顯著降低，且未見感染癥狀，證實PhoP/PhoQ對菌株毒力有維持作用；還有研究表明，該TCS突變的鼠傷寒沙門氏菌在小鼠巨噬細胞中的存活能力低于正常菌株，且毒力作用降低1 000多倍[31]。另外，Pukklay等[32]發(fā)現(xiàn)注射同樣劑量細菌的情況下，與正常大腸桿菌相比，OmpR/EnvZ缺陷菌株對果蠅的致死率降低30%，即OmpR/EnvZ對細菌毒力也有維持作用。Qing Xiaoyu等[33]針對鼠傷寒沙門氏菌中PhoP/PhoQ的RR蛋白PhoP進行研究，將該蛋白結(jié)合磷酸基團的天冬氨酸位點作為藥物作用的目標，驗證了藥物控制細菌毒力的可行性，這為降低食品微生物污染對消費者的危害提供了理論參考。

還有許多研究對比了多種細菌的正常與TCS缺陷菌株毒力基因的表達及毒素的產(chǎn)生，證實了金黃色葡萄球菌的AgrC/AgrA[24]和SaeS/SaeR[34]、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的RevS/RevR[35]、豬鏈球菌（Streptococcus suis）的NisK/NisR[36]等系統(tǒng)也與菌株毒性有關(guān)。

而游歷晉地的著名學(xué)者亦不乏其人，如唐代詩人李白、杜牧等人，宋代詩人梅堯臣等人，明代詩人謝榛等人，清初學(xué)者顧炎武、朱彝尊等人。 他們在游晉過程中，皆形成了一定的學(xué)術(shù)團體，在與晉地學(xué)人的交流中，促進了晉地學(xué)術(shù)的發(fā)展，也對提升山西學(xué)子水平起到了重要作用。

3.3 雙組分系統(tǒng)對耐藥性的調(diào)控

PhoP/PhoQ、PmrA/PmrB、CpxA/CpxR及BaeS/BaeR等系統(tǒng)均與細菌的耐藥性有關(guān)，且某些TCS可以協(xié)同激活生物膜成膜基因的表達，通過生物膜體系如QS、胞外分泌物的產(chǎn)生等進一步增強自身的耐藥性[37-38]。Huang Hui等[39]發(fā)現(xiàn)CpxA/CpxR突變菌的阿米卡星、慶大霉素等的最小抑菌濃度比正常菌株降低2～4 倍，說明CpxA/CpxR的存在可提升菌株的耐藥性。另外，有學(xué)者證實了CpxA/CpxR能夠參與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中外排泵MexAB-OprM的激活，且細菌能通過外排泵基因表達和脂多糖修飾的共同作用提高細胞的代謝活性，增強細菌對黏菌素的抵抗能力[38]。此外，雙組分系統(tǒng)在調(diào)控外排泵系統(tǒng)時，還可以同時控制沙門氏菌等的卷曲菌毛基因表達，細菌菌毛數(shù)量的增加有利于自身與相鄰細菌的互相黏附，進而形成穩(wěn)定的三維立體膜結(jié)構(gòu)，增強細菌對藥物的耐受能力[40]。因此，可以進一步從破壞雙組分系統(tǒng)或消除卷曲菌毛的角度，尋求降低細菌耐藥性和防止其在食品加工器具上形成生物膜的措施，例如可以用銀杏提取物等消除卷曲菌毛，降低食品的細菌污染[41]。

除上述調(diào)控作用外，TCS對細菌的調(diào)控作用還有很多，如ArcB/ArcA對細菌無氧呼吸的調(diào)節(jié)[42]；ActS/ActR能夠影響根瘤菌的固氮作用[43]；YpdA/YpdB和BtsS/BtsR與丙酮酸鹽感應(yīng)有關(guān)[44]等。

4 TCS對ATR的影響機制

細菌的ATR內(nèi)在機制主要包括以下3 個方面：酸休克蛋白或調(diào)節(jié)、保護蛋白對細胞的保護及生化過程的調(diào)節(jié)；細胞膜系統(tǒng)對質(zhì)子的阻擋及質(zhì)子外排；基于氨基酸代謝的細胞內(nèi)pH值平衡的維持。

4.1 TCS與酸休克蛋白

酸性環(huán)境可以激活細菌的TCS，進而產(chǎn)生一系列利于自身活性并參與細胞調(diào)控的酸休克蛋白，來保護菌體并修復(fù)其損傷的高分子，維持細菌在脅迫條件下的存活。細菌中的RpoS蛋白、OmpR調(diào)控子、PhoP/PhoQ系統(tǒng)和金屬調(diào)節(jié)子Fur等位于上游的調(diào)控蛋白均可影響酸休克蛋白的產(chǎn)生[45]，Lund等認為前兩者作用于ATR菌株的穩(wěn)定期，而PhoP/PhoQ和Fur則是在ATR對數(shù)期對酸休克蛋白的誘導(dǎo)起作用[46]。

PhoP/PhoQ不僅能夠調(diào)節(jié)下游酸休克蛋白的產(chǎn)生，其自身表達量在酸脅迫環(huán)境下也會增加，酸誘導(dǎo)菌株與未誘導(dǎo)組相比，細菌的PhoP/PhoQ等雙組分系統(tǒng)蛋白表達量上調(diào)，因此不少文獻也將雙組分系統(tǒng)稱為酸休克蛋白[9,11]。對于酸性環(huán)境中酸休克蛋白的產(chǎn)生途徑，多數(shù)研究認為酸信號是通過引起跨膜感應(yīng)蛋白質(zhì)域的構(gòu)象變化而產(chǎn)生酸休克蛋白[47]，但近來Choi等[48]發(fā)現(xiàn)當沙門氏菌胞外環(huán)境保持中性時，胞內(nèi)pH值下降也能誘導(dǎo)PhoP/PhoQ中PhoP激活下游耐酸響應(yīng)，產(chǎn)生酸休克蛋白；并且，當跨膜蛋白PhoQ胞內(nèi)域的氨基酸序列改變時能夠阻礙PhoP/PhoQ的pH值激活效應(yīng)，這說明，雙組分系統(tǒng)的感應(yīng)蛋白既能感知胞外的H+信號，又能利用自身的胞內(nèi)區(qū)域感知細胞內(nèi)部pH值的變化，進而將磷酸基團傳給RR蛋白，利于酸休克蛋白等的表達。

4.2 TCS與細胞膜的流動性

細菌細胞膜的脂肪酸含量和構(gòu)成發(fā)生改變時會影響其流動及通透性，較低的流動性和通透性可以抑制有毒有害物質(zhì)等進入菌體損傷細胞，增強細菌的存活能力[2]。能夠被PhoP/PhoQ系統(tǒng)激活的RpoS蛋白屬于一種RNA聚合酶σ因子，在持續(xù)性的耐酸調(diào)節(jié)機制上已得到廣泛證實[9,49]；在誘導(dǎo)耐酸過程中，RpoS蛋白可促進沙門氏菌等革蘭氏陰性菌細胞膜的不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)丙烷脂肪酸，降低膜的流動性，抑制食品加工中的酸性殘留物進入細胞，提高細菌的生存能力[9]。而對于單增李斯特菌等革蘭氏陽性菌，面對酸性壓力，菌株除了降低不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比率外，還能通過降低支鏈脂肪酸的數(shù)量調(diào)節(jié)膜的流動性，保證其生物活性，提升菌株的酸抵抗能力[50]。RpoS蛋白也可以調(diào)控酸休克蛋白的表達，說明RpoS蛋白作為多種耐酸路徑的核心蛋白，可將多個ATR的內(nèi)在機制相互交叉，使TCS通過調(diào)控RpoS蛋白進而控制多種耐酸機制的聯(lián)合作用。除脂肪酸外，孔道蛋白也是細菌細胞膜的重要組成結(jié)構(gòu)，OmpR/EnvZ系統(tǒng)的RR蛋白OmpR能夠直接作用于細菌的膜孔道蛋白OmpC和OmpF的編碼基因，從而控制對某些離子及小分子親水性物質(zhì)的過濾作用，進而對外界酸及藥物等作出響應(yīng)[8]。

4.3 TCS與氨基酸代謝

雙組分系統(tǒng)通過調(diào)控細菌氨基酸代謝相關(guān)基因的表達，影響酸性環(huán)境中的氨基酸代謝路徑，調(diào)控胞內(nèi)質(zhì)子的消耗及排出，進而對菌株細胞內(nèi)的pH值起穩(wěn)定作用，減少強酸對細胞的損傷。其中涉及的代謝相關(guān)的酶系統(tǒng)主要有精氨酸脫羧酶系統(tǒng)、賴氨酸脫羧酶系統(tǒng)、谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)等。

Brenneman等[54]發(fā)現(xiàn)在含精氨酸的培養(yǎng)基中，正常沙門氏菌可以在pH值為2.5的環(huán)境中生存，并且當精氨酸代謝相關(guān)基因adiA（編碼精氨酸脫羧酶）和adiC（編碼精氨酸-胍基丁胺逆向轉(zhuǎn)運子）同時被誘導(dǎo)時，phoPQ突變細菌通過完整的精氨酸代謝通路，能顯著增強自身在pH 3.0時的存活能力，驗證了精氨酸代謝系統(tǒng)對細菌的耐酸能力有提升作用，且該作用可能與PhoP/PhoQ系統(tǒng)有關(guān)。也有學(xué)者從蛋白質(zhì)角度進行研究，Tran等[3]通過定量蛋白質(zhì)組對phoPQ正常的沙門氏菌及變異菌株進行比對，發(fā)現(xiàn)變異組中精氨酸代謝相關(guān)的約10 種蛋白質(zhì)表達出現(xiàn)差異，說明細菌的精氨酸代謝與PhoP/PhoQ調(diào)控有關(guān)，而精氨酸代謝途徑又是細菌誘導(dǎo)耐酸作用的重要機制，由此可將PhoP/PhoQ與耐酸應(yīng)答聯(lián)系。

在細菌的賴氨酸代謝途徑中，Lee等[55]最先指出CadC作為OmpR/EnvZ的調(diào)節(jié)因子可控制沙門氏菌中至少36 種蛋白的表達，cadC不僅可以激活cadBA操縱子轉(zhuǎn)錄，同時還能激活OmpR/EnvZ并激發(fā)多種酸休克蛋白效應(yīng)，說明氨基酸代謝能反向作用于TCS進而調(diào)節(jié)下游耐酸效應(yīng)。之前有學(xué)者指出，與沙門氏菌正常菌株相比，ompR突變株穩(wěn)定期的誘導(dǎo)耐酸能力顯著降低，而對數(shù)期的耐酸響應(yīng)則無影響[56-57]。但近期Lee等[28]對早期對數(shù)期的沙門氏菌進行研究，結(jié)果表明OmpR/EnvZ中的OmpR和氨基酸代謝中的CadC兩種轉(zhuǎn)錄因子的表達水平之間存在負相關(guān)性，說明OmpR/EnvZ對沙門氏菌對數(shù)期的耐酸能力也有調(diào)控作用，且該結(jié)果再次證明雙組分系統(tǒng)與氨基酸代謝之間存在復(fù)雜的雙向調(diào)控，但其具體作用時間及調(diào)控耐酸響應(yīng)的機制仍待研究。

Ma Zhuo等[58]發(fā)現(xiàn)在質(zhì)量分數(shù)0.4%葡萄糖、pH 5.5的酸化條件下，大腸桿菌中EvgS/EvgA系統(tǒng)可通過調(diào)控gadE基因間接控制谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)中g(shù)adA和gadBC的表達，且與正常大腸桿菌相比，evgAS突變菌株gadA和gadBC的表達下調(diào)，說明EvgS/EvgA系統(tǒng)可以通過谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)間接影響谷氨酸依賴性耐酸。與PhoP/PhoQ類似，EvgS/EvgA也能對金屬離子（如Na+、K+）產(chǎn)生響應(yīng)[59]，但這些離子信號的存在是否能影響細菌雙組分系統(tǒng)對氨基酸代謝的調(diào)控仍不明確。

5 多個TCS之間的協(xié)同作用

一個TCS感知到應(yīng)激信號后，可以通過自身RR蛋白獨立作出應(yīng)答，也可以將信號通過立體的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)進行放大，通過再激活其他雙組分系統(tǒng)和/或σ因子等體系間接達到調(diào)控效果。

H+信號或低Mg2+信號（μmol級別）激活PhoP/PhoQ后，反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白PhoP發(fā)生磷酸化，促進pmrD基因的表達，PmrD再以一種未知的方式聯(lián)系到PmrA/PmrB系統(tǒng)，兩種雙組分系統(tǒng)能協(xié)同調(diào)控下游基因編碼的蛋白質(zhì)，可對脂多糖上脂質(zhì)A進行修飾[9,12]（圖1），在兩者共同調(diào)控的下游響應(yīng)中，酸激蛋白和氨基酸代謝基因可能是其調(diào)控目標，但這方面的研究仍不多見。

圖1 PhoP/PhoQTCS調(diào)控基因示意圖[60]Fig. 1 Schematic diagram of the regulatory genes of PhoP/PhoQ two-component regulatory system[60]

大腸桿菌中EvgS/EvgA與PhoP/PhoQ可以協(xié)同應(yīng)對酸性環(huán)境，有學(xué)者提出大腸桿菌中的EvgS/EvgA系統(tǒng)既可以通過激活下游的ydeO基因，使細菌從谷氨酸代謝角度獲得耐酸能力，又可以通過激活PhoP/PhoQ系統(tǒng)的HK PhoQ，進而由RR蛋白PhoP對H+作出調(diào)控[61]；還有學(xué)者提出EvgS/EvgA到PhoP/PhoQ到下游調(diào)控蛋白RssB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)模型，通過RssB防止PhoP/PhoQ響應(yīng)H+產(chǎn)生的RpoS蛋白發(fā)生降解，利于細菌在酸中存活[62]。

對于酸性環(huán)境下的金屬離子脅迫，細菌中也存在多種TCS協(xié)同作用的現(xiàn)象。例如關(guān)于沙門氏菌對酸性環(huán)境下高濃度Fe2+的吸收方式，有研究指出，細菌通過PhoP/PhoQ系統(tǒng)響應(yīng)環(huán)境中的H+信號后，能夠激活RstA/RstB系統(tǒng)，進而促進Fe2+轉(zhuǎn)運蛋白的生成和細胞對Fe2+的攝取，可見RstA/RstB和PhoP/PhoQ在幫助細菌應(yīng)對酸性環(huán)境下Fe2+脅迫時也存在協(xié)同作用[63]。

除酸性環(huán)境外，細菌在其他調(diào)控方面也存在多種TCS的協(xié)同作用。以O(shè)mpR/EnvZ為例，該TCS與PhoP/PhoQ在沙門氏菌高滲應(yīng)激方面[64]、AcrB/AcrA在大腸桿菌的外膜孔蛋白表達方面[65]以及SsrB/SsrA在沙門氏菌毒力島2基因表達方面[66]也存在交叉調(diào)節(jié)機制，即一個TCS的作用眾多，且同類基因可由多個TCS協(xié)同調(diào)控。

此外，TCS交叉調(diào)節(jié)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還體現(xiàn)在很多方面，如大部分存在于革蘭氏陰性菌中的cross-talk現(xiàn)象，即磷酸基團在HK和另一雙組分系統(tǒng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白間可逆?zhèn)鬟f的現(xiàn)象，比如HK EnvZ與非同源的CpxRRR蛋白（細胞膜張力），HKPhoR與非同源的調(diào)控蛋白NtrC（氮的同化作用），以及與金屬離子和能量代謝相關(guān)的CusS/CusR和CreC/CreB系統(tǒng)，協(xié)同控制鞭毛合成的QseB/QseC和RssA/RssB系統(tǒng)等[5,67]。

6 結(jié) 語

在食品加工過程中廣泛應(yīng)用的酸會引起細菌產(chǎn)生ATR，導(dǎo)致其不易被消毒劑致死，影響食品安全，而PhoP/PhoQ、PmrA/PmrB等常見的TCS在細菌應(yīng)對壓力環(huán)境時發(fā)揮重要作用。近年來，學(xué)者們比較正常細菌與TCS突變菌的下游基因或蛋白的表達水平，逐步探索TCS的信號識別及調(diào)控作用，但同時，TCS對強酸下細菌存活的具體調(diào)控機制、不同TCS間的協(xié)同作用仍沒有系統(tǒng)理論，正逐漸引起學(xué)者的關(guān)注。此外，不同信號對TCS的聯(lián)合激活機理仍不明確，例如動物源性食品的加工中，基于肉牛宰后肌細胞鈣泵失效導(dǎo)致的終池中大量Ca2+的游離，以及使用乳酸抑菌及死后糖酵解導(dǎo)致的H+濃度的上升，肉中豐富的Ca2+和H+信號是否存在著與Mg2+和H+類似的聯(lián)合激活作用目前尚無定論；H+是直接激活某一TCS，還是級聯(lián)其他TCS，然后間接激活耐酸效應(yīng)仍需探索。在未來的研究中，通過人為改變TCS作用過程中的“靶點”（如外界酸信號的感受位點、跨膜蛋白的磷酸化位點、磷酸基團到RR蛋白的轉(zhuǎn)移途徑等）來抑制細菌的耐酸能力和致病菌的毒力，增強食品生產(chǎn)中酸性抑菌措施的效果，也會成為一個新的研究領(lǐng)域。