陳蕾蕾，劉喚明*，鄧楚津，周春霞，洪鵬志，楊 萍

（廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院 廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088）

沙蟹汁是北海特有的傳統(tǒng)美食，是以沿海灘涂野生沙蟹為原料，通過天然發(fā)酵的方法制成的一款純天然、無任何添加劑的綠色食品。該產(chǎn)品有兩百多年的歷史，具有味道鮮美、口感醇厚等特點，深受沿海地區(qū)消費者喜愛?！吧承分瓲F豆角”、“沙蟹汁蘸白切雞”、“沙蟹汁蘸白灼蝦”等北海特色名菜都是以沙蟹汁為調(diào)味料制作而成的。沙蟹汁的生產(chǎn)還是傳統(tǒng)的手工工藝，存在質(zhì)量不穩(wěn)定、腥味重、色澤差等問題，另外沙蟹汁的核心發(fā)酵機制尚不明確。要對其質(zhì)量進行改善，必須先明確其發(fā)酵機制。目前對沙蟹汁報道較少，劉天天等[1]利用分子感官科學(xué)技術(shù)對沙蟹汁風(fēng)味行了分析；梁中永[2]對沙蟹汁中的不良風(fēng)味物質(zhì)進行檢測及去除研究，尚少見對沙蟹汁發(fā)酵過程中微生物的分析進行報道。

目前，對發(fā)酵魚露、發(fā)酵魚、發(fā)酵豆制品等發(fā)酵食品中微生物的研究已有所報道，并通過對微生物的分析，對傳統(tǒng)發(fā)酵工藝進行改進提供了一定的理論基礎(chǔ)；如黃紫燕等[3]對傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中的微生物進行了分析，并通過外加微生物對魚露的發(fā)酵工藝進行了改進[4]。齊寧利等[5]利用分子生物學(xué)高通量測序?qū)轸~露發(fā)酵過程中微生物菌相組成進行分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌和酵母菌為魚露發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌。朱雯娟等[6]對梅香魚發(fā)酵過程中的微生物進行篩選，并確定發(fā)酵菌株為木糖葡萄球菌（Staphylococ-cusxylosus）、嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcushalophilus）及腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus），利用發(fā)酵菌株對梅香魚進行發(fā)酵，更好的改善了魚制品的品質(zhì)。許家威等[7]研究了腐乳前酵期微生物與理化指標(biāo)之間的聯(lián)系，為工業(yè)化生產(chǎn)腐乳提供了一定的理論依據(jù)。

本實驗利用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝制備沙蟹汁，研究發(fā)酵過程中不同階段微生物的變化，檢測總氮、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮、游離氨基酸等理化指標(biāo)，將理化指標(biāo)與微生物的變化結(jié)合分析，試圖找出微生物與理化指標(biāo)之間的關(guān)系，明確微生物的作用，探討沙蟹汁發(fā)酵機理，為沙蟹汁的工藝改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙蟹、姜、海鹽：市售；營養(yǎng)瓊脂（nutrientagar，NA）培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、碳酸鉀、阿拉伯膠、甘油、甲基紅指示劑、次甲基藍(lán)指示劑、甲醇、鹽酸、甲醛（36%）、硫酸（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；細(xì)菌通用引物27F、1492R：生工生物工程（上海）有限公司；M ightyAmp脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、2×M ightyAmp Buffer：大連Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-2F型潔凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JB-1B型磁力攪拌器、PHS-3C型pH計：上海雷磁儀器有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀：珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；Vapodest450全自動凱氏定氮儀：德國格哈特（Gerhardt）分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙蟹汁的制作

新鮮沙蟹清洗、去腸，瀝干至無水流下為止，沙蟹5 kg、姜300 g，一起搗碎，加入2 kg海鹽，攪勻，繼續(xù)搗碎，加入3 L涼開水，攪勻，裝缸，封存，25℃發(fā)酵15 d，即為沙蟹汁。

1.3.2 微生物檢測

按照傳統(tǒng)工藝制備沙蟹汁，每隔3 d在無菌環(huán)境中取發(fā)酵液進行分析。取樣前，將沙蟹汁混勻，于4 000 r/min離心10m in后取上清液，梯度稀釋后選取3個合適的稀釋度涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)48 h，選取菌落數(shù)在30～300之間平板計數(shù)，1個稀釋度選擇3個平板。根據(jù)菌落形態(tài)挑取不同的菌，劃線分離純化至鏡檢觀察為純培養(yǎng)物，斜面保存。

1.3.3 微生物的16S rDNA鑒定

分離微生物的鑒定利用27F和1492R細(xì)菌通用引物作為正反向引物，利用M ightyAmp DNA Polymerase進行細(xì)菌菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增[8]。PCR擴增體系：27 F 1.5μL，1492R 1.5μL，M ightyAmp DNA Polymerase 1.5μL，2×M ightyAmp Buffer 30μL，雙蒸水（ddH2O）25.5μL，擴增條件：98℃（預(yù)變性）2min，98℃（變性）10 s，55℃（復(fù)性）15 s，68℃（延伸）90 s，72℃延伸10min，從變性到第一次延伸這個過程循環(huán)40次[6]，將PCR產(chǎn)物送至上海生工公司測序，將測序結(jié)果利用BLAST搜索程序從GenBank進行同源性檢索，并下載相似性高的模式菌株的16S rDNA基因序列進行分析。

1.3.4 理化指標(biāo)測定

總氮含量的測定：采用凱氏定氮法[9]；氨基酸態(tài)氮含量的測定：參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測定》甲醛滴定法[10]；揮發(fā)性鹽基氮含量的測定：參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》康維皿法（微量擴散法）[11]；氨基酸含量的測定：參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》[12]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2016及Origin 8.0對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離純化及鑒定

本實驗采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從不同發(fā)酵時間的沙蟹汁分離出5種微生物，將5種微生物的16S rDNA序列，經(jīng)BLAST在線比對得出相似菌株，5種微生物菌落形態(tài)及相似菌株如表1所示。

表1 5種微生物菌落形態(tài)及16S rDNA序列比對結(jié)果Table 1 Comparison results of colony morphology and 16S rDNA of 5 m icroorganisms

由表1可知，沙蟹汁發(fā)酵過程中主要有5種微生物，分別是馬胃葡萄球菌（Staphylococcusequorum subsp.）、阿爾萊特葡萄球菌（Staphylococcusarlettae）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、解淀粉鹽水球菌（Salinicoccus amy-lolyticus）及蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）。馬胃葡萄球菌在發(fā)酵產(chǎn)品中已有報道，吳麗紅[13]在川香味香腸腌制、自然發(fā)酵、烘烤和經(jīng)真空包裝后保藏過程中分離出馬胃葡萄球菌，馬胃葡萄球菌為整個過程中的優(yōu)勢菌；陳學(xué)云等[14]從鹽干帶魚中分離出3株馬胃葡萄球菌，3株腐生葡萄球菌；李欣等[15]從錦州蝦醬中分離產(chǎn)蛋白酶嗜鹽菌，分離得到4株馬胃葡萄球菌，證明馬胃葡萄球菌具有產(chǎn)蛋白酶能力；謝科[16]利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradientgel electrophoresis，PCR-DGGE）指紋圖譜分析得到，阿爾萊特葡萄球菌為廣式臘腸發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群之一。李丙超等[17]對傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中菌種進行了分子生物學(xué)鑒定，指出腐生葡萄球菌含量比較豐富。發(fā)酵產(chǎn)品中對解淀粉鹽水球菌的報道較少，SRINIVASA等[18]從鹽地里分離得到一株解淀粉鹽水球菌，并對其特性進行研究表明，該菌株最適生長鹽度為25%，沙蟹汁鹽度為24%，適合解淀粉鹽水球菌的生長。

2.2 沙蟹汁發(fā)酵過程中微生物的變化

沙蟹汁發(fā)酵過程中菌落總數(shù)變化結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，沙蟹在絞碎后，未進行發(fā)酵時存在一定的微生物，其可能來源于空氣或者沙蟹內(nèi)部存在的微生物，在發(fā)酵的過程中適合發(fā)酵環(huán)境的微生物繼續(xù)生存，不適合發(fā)酵環(huán)境的微生物被淘汰掉。在發(fā)酵前3 d時，沙蟹汁中微生物數(shù)量急劇增加，達到2.6×107CFU/m L；發(fā)酵3 d后，微生物數(shù)量減少，其可能的原因是高鹽度使得大多數(shù)不適合生存的微生物死亡，沙蟹汁發(fā)酵速度緩慢。

圖1 沙蟹汁發(fā)酵過程中菌落總數(shù)變化Fig.1 Changes of totalnumber of bacterial colony in crab sauce fermentation process

沙蟹汁發(fā)酵過程中各種微生物的變化結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，沙蟹汁發(fā)酵過程中（0～15 d）優(yōu)勢微生物為馬胃葡萄球菌；發(fā)酵0～3 d有阿爾萊特葡萄球菌出現(xiàn)；發(fā)酵第6天有腐生葡萄球菌出現(xiàn)；發(fā)酵6～15 d時蠟樣芽孢桿菌數(shù)量大幅增加；發(fā)酵第9天時出現(xiàn)解淀粉鹽水球菌。表明從發(fā)酵第6天開始出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象。

圖2 沙蟹汁發(fā)酵過程中微生物組成變化Fig.2 Changes ofm icrobiologicalcompositions in crab sauce fermentation process

2.3 沙蟹汁發(fā)酵過程中理化指標(biāo)變化

2.3.1 沙蟹汁發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

沙蟹汁發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，沙蟹汁發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮在前6 d迅速增加，6 d以后增加緩慢，在第15天時，沙蟹汁中氨基酸態(tài)氮含量達到0.43 g/100m L，達到三級魚露氨基酸態(tài)氮含量標(biāo)準(zhǔn)[19]。氨基酸態(tài)氮的變化是蟹肉在微生物及酶的共同作用結(jié)果，沙蟹汁中5種微生物有一定的產(chǎn)蛋白酶能力，但產(chǎn)蛋白酶能力較弱，說明其發(fā)酵過程中前期氨基酸態(tài)氮的變化主要是沙蟹自身內(nèi)源酶作用的結(jié)果。在發(fā)酵前期，內(nèi)源酶活性較高，底物濃度較大，氨基酸態(tài)氮含量迅速增加；隨著發(fā)酵時間的延長，內(nèi)源酶酶活性降低，主要依靠微生物蛋白酶酶解，此外到發(fā)酵后期，蟹肉被酶解完全，所以氨基酸態(tài)氮含量變化緩慢。

圖3 沙蟹汁發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化Fig.3 Changes of am ino acid nitrogen contents in crab sauce fermentation process

2.3.2 沙蟹汁發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮含量變化

揮發(fā)性鹽基氮是產(chǎn)品發(fā)酵過程中腐敗微生物作用的產(chǎn)物，標(biāo)志著水產(chǎn)品新鮮與否的質(zhì)量指標(biāo)。沙蟹汁發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮含量的變化結(jié)果見圖4。由圖4可知，沙蟹汁在發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮含量增加，發(fā)酵前期增加緩慢，發(fā)酵12～15 d增加迅速。發(fā)酵15 d時，沙蟹汁中揮發(fā)性鹽基氮含量為105mg/100m L，這與發(fā)酵過程中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量增加有關(guān)。ANIHOUVIVB等[20]研究報道，經(jīng)自然發(fā)酵的木薯魚揮發(fā)性鹽基氮含量達到（264.7～389.9）mg/100g；GASSEM M A等[21]對沙特阿拉伯腌漬發(fā)酵魚微生物及理化性質(zhì)進行研究表明，其揮發(fā)性鹽基氮含量范圍為（32.2～131.82）mg/100 g。較高的揮發(fā)性鹽基氮的含量表明氨基酸被破壞的越多，為產(chǎn)品安全性帶來隱患，需要對其控制進行研究。

圖4 沙蟹汁發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮含量變化Fig.4 Changes of volatile basic nitrogen contents in crab sauce fermentation process

2.3.3 沙蟹汁發(fā)酵過程中總氮含量變化

沙蟹汁發(fā)酵過程中總氮含量的變化結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，沙蟹汁發(fā)酵過程前9d總氮含量上升至0.76g/100m L，其原因可能是因為在前9 d，內(nèi)源酶活性較高，分解蟹肉蛋白的能力較強，這與發(fā)酵前期沙蟹汁氨基態(tài)氮含量增加較快的結(jié)論一致，但在9～12 d時，沙蟹汁總氮含量降低，其原因可能是微生物的代謝消耗較多，由2.2可以看出，發(fā)酵至第9 d時，解淀粉鹽水球菌出現(xiàn)，代謝較快，消耗總氮，導(dǎo)致其總氮含量下降。發(fā)酵第12天時，蠟樣芽孢桿菌數(shù)量增加，這也導(dǎo)致2.3.2中揮發(fā)性鹽基氮的大幅度增加，由于蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶，使得沙蟹汁中總氮和氨基酸態(tài)氮增加，并且此時沙蟹汁中活菌數(shù)降低，微生物消耗量也減少，最終導(dǎo)致產(chǎn)品中總氮含量上升。

圖5 沙蟹汁發(fā)酵過程中總氮含量變化Fig.5 Changes of totalnitrogen contents in crab sauce ferm entation process

2.4 沙蟹汁發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化

沙蟹汁發(fā)酵過程中游離氨基酸含量變化結(jié)果如表2所示，由表2可知，在發(fā)酵前6 d，沙蟹汁中游離氨基酸的含量增加，達到3.06g/100m L，6 d后游離氨基酸的量變化緩慢，后期略有降低，這說明沙蟹蟹肉的酶解主要是在前6d，這與2.3.1氨基酸態(tài)氮含量的變化相符。后期降低可能是因為腐敗微生物的作用，發(fā)酵環(huán)境發(fā)生變化，游離氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)性鹽基氮等物質(zhì)，這與齊利寧等[5]對江洪魚露發(fā)酵過程中氨基酸分析結(jié)果相似。在所有游離氨基酸中，谷氨酸的含量最高，在沙蟹汁發(fā)酵過程中谷氨酸含量略有增加，谷氨酸為鮮味氨基酸，是水產(chǎn)品調(diào)味料鮮味的主要來源。其次沙蟹汁發(fā)酵過程中含量較高的氨基酸還有天冬氨酸、丙氨酸及精氨酸，劉天天[1]研究表明，沙蟹汁中甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸及精氨酸滋味活性值（tasteactive value，TAV）均＞1，是沙蟹汁鮮味成分的主要貢獻者。沙蟹汁中鮮味氨基酸的增加主要在前6 d，到后期了增加緩慢然后略有降低。

表2 沙蟹汁發(fā)酵過程中游離氨基酸的組成與含量Table 2 Composition and content of free am ino acid in crab sauce fermentation process g/100 m L

3 結(jié)論

沙蟹汁發(fā)酵過程中微生物主要有馬胃葡萄球菌、阿爾萊特葡萄球菌、腐生葡萄球菌、解淀粉鹽水球菌及蠟樣芽孢桿菌，其中馬胃葡萄球菌為優(yōu)勢菌。發(fā)酵過程中菌落總數(shù)在第3天達到2.6×107CFU/m L，高鹽度導(dǎo)致后期降低，最終達到7.6×105CFU/m L。氨基酸態(tài)氮含量在整個發(fā)酵過程中增加，前期增加較快，后期變的緩慢，其含量最終達到0.43 g/100m L，揮發(fā)性鹽基氮含量前期增加較慢，后期增加較快，最終含量達到105mg/100m L，總氮和游離氨基酸含量均呈現(xiàn)先增加后降低，最終分別達到0.72 g/100m L、2.99 g/100m L。

沙蟹汁發(fā)酵過程中，微生物產(chǎn)蛋白酶能力較弱，發(fā)酵前期蟹肉的酶解主要是沙蟹體內(nèi)內(nèi)源酶的作用，后期主要是微生物蛋白酶酶解，其理化指標(biāo)的變化與微生物有一定的聯(lián)系。本研究明確了沙蟹汁發(fā)酵過程中微生物與理化指標(biāo)變化之間的聯(lián)系，為沙蟹汁的研究及傳統(tǒng)工藝的改進奠定了一定的基礎(chǔ)。