程怡 薛誠(chéng) 吳金友 林海洋 趙佳佳 毛小潔

隨著2型糖尿病患病人數(shù)的增多，疾病本身及其慢性并發(fā)癥已成為嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是2型糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，是發(fā)達(dá)國(guó)家成人致盲的主要原因[1]。多種途徑的炎癥反應(yīng)損傷血管內(nèi)皮，是DR的重要發(fā)病機(jī)制之一[2]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）屬于趨化因子家族成員，是一種對(duì)單核細(xì)胞有趨化作用的炎癥細(xì)胞因子[3]。有證據(jù)表明，MCP-1參與介導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡和視網(wǎng)膜血管再生[4]。位于MCP-1基因啟動(dòng)子區(qū)的-2518A/G位點(diǎn)多態(tài)性會(huì)影響MCP-1的表達(dá)[5]?；诖?，本研究通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCRRFLP）技術(shù)檢測(cè)基因多態(tài)性，旨在探討MCP-1基因-2518A/G位點(diǎn)多態(tài)性與DR的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2014至2017年本院收治的2型糖尿病患者192例（DM組），其中男91例，女101例；年齡50～81歲。DM組患者均為中國(guó)浙江地區(qū)漢族人，相互之間無(wú)血緣關(guān)系，排除1型糖尿病、伴有急慢性感染性疾病、嚴(yán)重心腦血管病變、妊娠、自身免疫性疾病、惡性腫瘤以及因青光眼、白內(nèi)障和其他眼底血管性疾病等原因?qū)е卵鄣谉o(wú)法分級(jí)者。DM組患者住院期間由專業(yè)眼科醫(yī)師行眼底檢查及眼底照相。根據(jù)2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)眼底病學(xué)組的分期方法[6]，將DM組患者分為DR組（93例）和非DR組（99例）；DR組又分為2個(gè)亞組，增殖性視網(wǎng)膜病變亞組（PDR亞組，45例）和非增殖性視網(wǎng)膜病變亞組（NPDR亞組，48例）。另?yè)裢谠诒驹盒薪】刁w檢者109例作為對(duì)照組，其中男50例，女59例；年齡45～76歲。對(duì)照組受檢者均為漢族人，實(shí)驗(yàn)室檢查證實(shí)無(wú)糖尿病，無(wú)高血壓、心臟病、肝臟和腎臟疾病史，且無(wú)糖尿病、眼底疾病家族史。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集并記錄DM組患者與對(duì)照組受檢者年齡、性別、糖尿病病史及治療史、其他重大疾病史、家族史等，測(cè)身高、體重、收縮壓、舒張壓及腰圍，計(jì)算BMI；留取血標(biāo)本，測(cè)定空腹血糖（FPG）、餐后2h血糖（2hPG）、糖化血紅蛋白（HbA1C）、C 肽、TC、TG、HDLC、LDL-C等生化指標(biāo)。

1.2.2 MCP-1基因-2518A/G位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) 采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)基因多態(tài)性。采用德國(guó)QIAGEN公司的DNA提取試劑盒（50T，51104）提取的DM組患者與對(duì)照組受檢者外周血白細(xì)胞DNA作為模板，聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)上游引物序列5′-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3′，下游引物序列 5′-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為930bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min，94℃變性 30s，64℃退火 30s，72℃延伸 30s，上述循環(huán) 40次，最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以PvuⅡ內(nèi)切酶（New England Biolabs，US，25 000units，R0151）進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色后于紫外線成像儀中觀察。由于MCP-1基因-2518A/G位點(diǎn)有PvuⅡ酶切位點(diǎn)，所以AA基因型酶切片段為930bp，AG 基因型為 930、708 和 222bp，GG 基因型為708和222bp。選取經(jīng)酶切鑒定攜帶不同基因型的PCR產(chǎn)物樣本各1份委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，與酶切結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較DR組、非DR組和對(duì)照組一般情況及生化指標(biāo)；（2）比較DM組患者與對(duì)照組受檢者M(jìn)CP-1基因-2518A/G位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布情況；（3）分析DR相關(guān)危險(xiǎn)因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)算各組的基因型和等位基因頻率分布情況，采用Hardy-Weinberg平衡公式檢驗(yàn)各組基因型是否達(dá)到遺傳平衡。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。DR相關(guān)危險(xiǎn)因素分析采用logistic回歸。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DR組、非DR組和對(duì)照組一般情況及生化指標(biāo)比較 DR組與非DR組患者年齡、收縮壓、舒張壓、腰圍、BMI、FPG、2hFPG、HbA1C、TG、LDL-C 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。DR、非DR組患者年齡、收縮壓、舒張壓、腰圍、BMI、FPG、2hFPG、HbA1C、TG、LDL-C 均高于對(duì)照組受檢者（均P＜0.05）。DR組患者年齡、糖尿病病程均大于非DR組患者（均P＜0.05），而DR組患者與非DR組患者收縮壓、舒張壓、腰圍、BMI、FPG、2hPG、HbA1C、C 肽、TC、TG、HDL-c、LDL-c 比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表 1。

表1 DR組、非DR組和對(duì)照組一般情況及生化指標(biāo)比較

2.2 DM組患者與對(duì)照組受檢者M(jìn)CP-1基因-2518A/G位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布情況比較 DM組患者AA基因型頻率為29.2%，高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；DM組患者A等位基因頻率為51.8%，高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DR、非DR、對(duì)照組AA基因型頻率分別為37.6%、21.2%、14.7%，A等位基因頻率為57.0%、47.0%和39.4%，DR組AA基因型頻率高于非DR組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），DR組A等位基因頻率高于非DR組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。PDR亞組與NPDR亞組MCP-1基因-2518A/G位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 DM組患者與對(duì)照組受檢者M(jìn)CP-1基因-2518A/G位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布情況比較[例（%）]

2.3 DR相關(guān)危險(xiǎn)因素分析 以DR的發(fā)生與否為因變量，選擇MCP-1基因-2518A/G位點(diǎn)基因型、年齡、糖尿病病程、收縮壓、舒張壓、腰圍、BMI、FPG、2hPG、HbA1C、TC、TG、HDL-C 和 LDL-C 為自變量，作 logistic回歸分析，結(jié)果顯示，MCP-1基因-2518A/G位點(diǎn)多態(tài)性及糖尿病病程與DR的發(fā)生有關(guān)，AA基因型及糖尿病病程長(zhǎng)是DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表3。

表3 DR相關(guān)危險(xiǎn)因素的logistic分析

3 討論

DR是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病是由多種因素共同參與、相互作用導(dǎo)致，具體機(jī)制尚不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥細(xì)胞因子和趨化因子參與DR的發(fā)病過(guò)程，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、細(xì)胞間黏附分子-1和MCP-1等[7-9]。

MCP-1是一種炎癥細(xì)胞趨化因子，參與多種在單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)，包括誘導(dǎo)超氧化陰離子、細(xì)胞因子產(chǎn)生和黏附分子表達(dá)[9]。在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠玻璃體、視網(wǎng)膜血管壁和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的MCP-1水平升高，激活視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放炎癥因子，參與DR相關(guān)的炎癥反應(yīng)[10]。葡萄糖和糖化血清白蛋白刺激MCP-1在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)表達(dá)[11]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)眼內(nèi)的MCP-1水平在DR患者中較高，為對(duì)照組的2.2倍[12]。

關(guān)于MCP-1基因多態(tài)性與DR的相關(guān)性研究目前報(bào)道不多，且結(jié)論并不一致。Jeon等[13]在對(duì)590例2型糖尿病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，MCP-1基因-2518A/G位點(diǎn)AA基因型與PDR的發(fā)生有關(guān)，而Katakami等[14]及Dong等[15]研究卻認(rèn)為-2518A/G位點(diǎn)GG基因型及G等位基因增加DR包括PDR的患病風(fēng)險(xiǎn)。本研究以中國(guó)浙江地區(qū)漢族人為研究對(duì)象，比較了DM組和對(duì)照組MCP-1基因-2518A/G位點(diǎn)多態(tài)性的分布差異。結(jié)果表明，DM組AA基因型頻率和A等位基因頻率高于對(duì)照組，提示AA基因型及A等位基因與2型糖尿病易感性有關(guān)。該結(jié)果與馬江波等[16]研究結(jié)果相符。本研究還發(fā)現(xiàn)，DR組AA基因型頻率和A等位基因頻率高于非DR組，logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者M(jìn)CP-1基因-2518A/G位點(diǎn)多態(tài)性及糖尿病病程與DR的發(fā)生有關(guān)。

本研究結(jié)果反映了浙江地區(qū)漢族人MCP-1基因-2518A/G位點(diǎn)多態(tài)性與DR的關(guān)系，該位點(diǎn)的多態(tài)性可能通過(guò)影響MCP-1基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯影響視網(wǎng)膜血管表達(dá)MCP-1，趨化吸引單核細(xì)胞的聚集從而引起毛細(xì)血管的阻塞，同時(shí)誘導(dǎo)多種途徑的炎癥反應(yīng)損傷血管內(nèi)皮，最終導(dǎo)致DR的發(fā)生。本研究結(jié)果與目前已知的國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果并非完全一致的原因可能有：首先，該基因位點(diǎn)突變存在種族差異性，基因型及等位基因的頻率在各項(xiàng)研究中并不一致；其次，部分其他研究樣本的糖尿病病程較短，各組間血糖水平存在差異，本研究中DR組和非DR組糖尿病病程均較長(zhǎng)（平均病程＞10年），而兩組間血糖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但是本研究樣本量不夠大（301例）可能也是造成結(jié)果偏差的原因。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示MCP-1基因-2518A/G位點(diǎn)多態(tài)性與2型糖尿病患者DR發(fā)生有關(guān)，其中AA基因型可能是浙江局部地區(qū)漢族人群中2型糖尿病患者發(fā)生DR的危險(xiǎn)因素，A等位基因可能增加該人群DR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但由于DR的發(fā)生、發(fā)展是多種遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，進(jìn)一步研究MCP-1基因與其它基因以及環(huán)境因素等的相互影響有助于深入揭示DR發(fā)生的病理生理機(jī)制。