楊毅 李文燕 盛泳佳 王瑾 陳啟緒 韓晨陽

慢性髓性白血病（CML）是造血干細胞異常轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的一種髓系惡性克隆白血病，遺傳學(xué)特征表現(xiàn)為t（9；22）（q34；q11）易位，產(chǎn)生BCR-ABL融合基因，該融合基因翻譯的蛋白屬于非受體酪氨酸激酶，其二聚體形式可以導(dǎo)致底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化，激活多條信息傳遞途徑，干擾細胞的基本活動[1-2]。目前臨床治療CML的方法包括以羥基脲為主要藥物的化療、INF-α以及異基因造血干細胞移植等[3-4]。伊馬替尼（IMA）作為選擇性的酪氨酸激酶抑制劑，是CML首選靶向治療藥物，對初發(fā)慢性期CML患者可達到完全細胞遺傳學(xué)反應(yīng)（CCR），1 年無病生存率可達到 100%[5-6]。然而，IMA的耐藥現(xiàn)象在臨床中也并不鮮見。研究發(fā)現(xiàn)，IMA的耐藥過程牽涉多種機制，α-1酸性糖蛋白AGP的產(chǎn)生、耐藥基因MDR-1的過度表達、BCR-ABL基因擴增或突變是耐藥產(chǎn)生的主要原因[7]。因此，如何治療IMA耐藥的CML是當前臨床研究的熱點。

近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬性耐藥或是耐藥產(chǎn)生的一大機制。鉑類藥物、烷化劑等耐藥與細胞自噬的誘導(dǎo)有關(guān)，CML化療常用藥物紫杉醇可以通過細胞自噬激活產(chǎn)生耐藥[8]。而臨床應(yīng)對此種耐藥常常會聯(lián)合使用自噬抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇耐藥的CML細胞K562采用羥氯喹預(yù)處理，可以顯著提高細胞的藥物敏感性，機制在于羥氯喹抑制酸性囊泡的產(chǎn)生，間接抑制細胞自噬的發(fā)生[9-10]?；诖?，本研究將細胞自噬抑制劑羥氯喹聯(lián)合伊馬替尼作用于CML K562/IMA細胞株，觀察其對該細胞株耐藥的影響，并探討其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 CML K562/IMA細胞株（嘉興市第二醫(yī)院實驗室自備，對10μmol/L的IMA耐藥），IMA和羥氯喹標準品（北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號7330441、100582），CCK-8檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號 C0037），Transwell小室（康寧公司），Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（美國BD公司），單丹磺酰尸胺（MDC）染色試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號25875），免疫熒光染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號 P0179），LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、Beclin-1 以及Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 的單克隆抗體（Cell Signaling Technology公司，批號4108、39749、3495、2772、3498、9662、9502）。電子分析天平（梅特勒-托里多儀器有限公司，型號ME204E），DP11顯微鏡（日本奧林巴斯公司），PCR儀（型號 BS97MyCycler），Western blot電泳儀（型號1658001），F(xiàn)ACS CantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 K562/IMA細胞株復(fù)蘇后，采用RPMI 1640完全培養(yǎng)基+10%FBS培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期后，將細胞分為對照組（Con組）、IMA干預(yù)組（IMA組）、羥氯喹+IMA干預(yù)組（HCQ+IMA組）。Con組為常規(guī)培養(yǎng)的細胞，無藥物干預(yù)；IMA組采用含10μmol/L IMA的培養(yǎng)基培養(yǎng)；HCQ+IMA組采用含10μmol/L羥氯喹的培養(yǎng)基培養(yǎng)（預(yù)處理）12h后，再用含10μmol/L IMA的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖率 將對數(shù)生長期的K562/IMA細胞接種到96孔板中，IMA組和HCQ+IMA組采用含10μmol/L IMA的培養(yǎng)基培養(yǎng)。設(shè)置時間點為0、6、12、18、24、30、36h，待培養(yǎng)完成后加入 10μl的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用酶標儀在480nm處檢測吸光度（A值）。細胞增殖率（%）=[A（加藥）-A（空白）] /[A（對照）-A（空白）] ×100%

1.2.3 Annexin V-FITC/PI染色后流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 將對數(shù)生長期的K562/IMA細胞接種到6孔板中，IMA組和HCQ+IMA組采用濃度為10μmol/L的IMA干預(yù)，加藥后培養(yǎng)24h，收集細胞后加入Binding Buffer重懸。而后加入Annexin V-FITC液10μl混勻，避光反應(yīng)10min，再加入10μl的 PI染色避光反應(yīng)10min，PBS洗去多余染色液后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 將對數(shù)生長期的K562/IMA細胞加入Transwell小室，IMA組和HCQ+IMA組采用含10μmol/L IMA的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中不加FBS，而24孔板下室加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含10%的FBS，待培養(yǎng)24h后取出小室，棄去培養(yǎng)基，甲醇固定后用0.1%的結(jié)晶紫染色，棉簽擦去上層未遷移的細胞后鏡下觀察。

1.2.5 免疫熒光染色檢測細胞自噬激活標志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表達 將對數(shù)生長期的K562/IMA細胞接種到6孔板中，IMA組和HCQ+IMA組采用含10μmol/L IMA的培養(yǎng)基培養(yǎng)，將細胞培養(yǎng)基棄去，用甲醇固定后自然干燥，PBS洗3次，1%的Triton液處理30min，羊血清處理 30min，LC3Ⅰ/Ⅱ一抗（1∶500）稀釋后在 4℃下孵育過夜，次日用PBS洗凈一抗，二抗標記后晾干封片；使用熒光分光光度計檢測熒光強度。

1.2.6 MDC染色檢測細胞酸性囊泡 將對數(shù)生長期的K562/IMA細胞接種到6孔板中，IMA組和HCQ+IMA組采用含10μmol/L IMA的培養(yǎng)基培養(yǎng)6h后棄去培養(yǎng)基，用去離子水稀釋漂洗液 Wash Buffer（1∶1 稀釋），細胞用稀釋后的Wash Buffer重懸后調(diào)整細胞濃度為106/ml，加入MDC染色液染色后室溫避光染色30min，染色后用Wash Buffer清洗，滴加細胞液在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為355nm，阻斷波長為512nm，計染色陽性（黃綠色）細胞數(shù)。

1.2.7 Western blot法檢測細胞自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin-1 及凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表達 將對數(shù)生長期的K562/IMA細胞接種到6孔板中，IMA組和HCQ+IMA組采用含10μmol/L IMA的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后收集各組細胞。PBS洗2次后，在冰上加入NP-40裂解液100μl裂解30min，3 000r/min離心后收集上清液；BCA法進行蛋白定量后調(diào)整蛋白濃度，根據(jù)蛋白分子量分別配置8%～12%的SDS-PAGE凝膠，取蛋白液用5×上樣緩沖液Loading Buffer補充體積至20μl，煮沸8min后進行電泳，電壓80V，之后轉(zhuǎn)換為120V，將凝膠去除后進行PVDF膜的轉(zhuǎn)膜；采用300mA恒流轉(zhuǎn)膜0.5～2h，PVDF膜使用5%脫脂奶粉封閉2h；TBST稀釋一抗，一抗孵育后PVDF膜用TBST洗2次再用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育。孵育完成后用化學(xué)發(fā)光法檢測，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進行光密度分析，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白光密度值比表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組細胞增殖率比較 見圖1。

圖1 3組細胞增殖率比較（與Con組比較，*P＜0.05；與IMA組比較，△P＜0.05）

由圖 1 可見，培養(yǎng) 6、12、18、24、30、36h 時，3 組細胞增殖率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且HCQ+IMA組＜IMA組＜Con組（均P＜0.05）。Con組細胞0～36h時間段內(nèi)呈增殖狀態(tài)，隨著時間的延長，細胞增殖率增高；IMA組細胞隨著時間的延長，細胞增殖率無明顯變化，說明細胞生長受到抑制；HCQ+IMA組細胞隨著時間的延長，細胞增殖率出現(xiàn)負增長，且細胞活力逐漸降低。這說明，羥氯喹預(yù)處理后，IMA可以明顯抑制K562/IMA細胞的增殖。

2.2 3組細胞凋亡率比較 見圖2。

圖2 3組細胞流式細胞圖比較

由圖2可見，Con、IMA、HCQ+IMA組細胞凋亡率分別為（0.98±0.22）%、（15.35±2.14）%、（38.65±5.32）%，3 組細胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且HCQ+IMA組＞IMA組＞Con組（均P＜0.05）。

2.3 3組細胞侵襲能力比較 見圖3。

由圖3可見，Con、IMA、HCQ+IMA組細胞遷移數(shù)目分別為（59.32±8.32）、（63.22±7.52）、（25.32±5.32）個/視野，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩兩比較，HCQ+IMA組＜Con組（P＜0.05），HCQ+IMA組＜IMA組（P＜0.05），Con組與IMA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。即HCQ+IMA組細胞侵襲能力低于Con、IMA組。

2.4 3組細胞自噬激活標志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表達情況比較 見圖4。

由圖4可見，Con組細胞LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白為陰性表達，細胞中幾乎無LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達，說明細胞自噬未激活；IMA組細胞LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白熒光強度明顯高于Con組；而HCQ/IMA組細胞與IMA組比較，LC3蛋白熒光強度明顯降低，說明細胞自噬受到了抑制。

圖3 Transwell小室檢測3組細胞侵襲能力顯微鏡下所見（結(jié)晶紫染色，×200）

圖4 3組細胞自噬激活標志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表達情況比較（免疫熒光染色，×400）

2.5 3組細胞酸性囊泡染色陽性細胞數(shù)比較 見圖5。

圖5 3組細胞酸性囊泡染色陽性細胞數(shù)比較（MDC染色，×200）

由圖5可見，Con、IMA、HCQ+IMA組酸性囊泡染色陽性細胞數(shù)分別為（16.36±2.56）、（56.35±6.68）、（35.65±3.25）個/視野，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且IMA組＞HCQ+IMA組＞Con組（均P＜0.05）。即羥氯喹干預(yù)后可以減少細胞中酸性囊泡的形成。

2.6 3組細胞自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin-1及凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 表達情況比較見圖6-7。

圖6 3組細胞自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin-1表達情況比較（與Con組比較，*P＜0.05；與IMA組比較，△P＜0.05）

圖7 3組細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達情況比較（與Con組比較，*P＜0.05；與IMA組比較，△P＜0.05）

由圖6可見，3組細胞自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin-1表達水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。細胞自噬底物蛋白p62表達水平兩兩比較，Con組（0.80±0.11）＞HCQ+IMA 組（0.35±0.05）＞IMA 組（0.12±0.11）（均P＜0.05）；自噬啟動調(diào)節(jié)蛋白Beclin-1表達水平兩兩比較，IMA 組（0.62±0.08）＞Con組（0.42±0.10）、HCQ+IMA 組（0.40±0.03）（均 P＜0.05），而 Con 組與HCQ+IMA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。由圖7可見，3 組細胞凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。凋亡蛋白 Bax、Caspase-3、Caspase-9 表達水平兩兩比較，Con 組（0.32±0.05、0.20±0.03、0.15±0.03）＜IMA組（0.52±0.06、0.32±0.05、0.26±0.03）＜HCQ+IMA 組（1.15±0.13、0.45±0.06、0.42±0.03）（均 P＜0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平兩兩比較，Con組（0.50±0.05）＞IMA 組（0.13±0.02）＞HCQ+IMA 組（0.06±0.01）（均 P＜0.05）。

3 討論

20世紀90年代問世的IMA是一種選擇性的酪氨酸激酶抑制劑，大量的臨床試驗已經(jīng)證明，400mg/d劑量的IMA長期服用可以使得80%以上的初發(fā)期CML患者達到CCR，而急性期的患者可以到34%以上，是一種治療CML的有效藥物。但是長期使用IMA，部分患者會出現(xiàn)耐藥，這種耐藥主要指慢性期患者未出現(xiàn)完全血液學(xué)反應(yīng)或者加速期和急變期患者未有效達到慢性期[11]。對于IMA的耐藥，目前臨床應(yīng)對方法十分有限，加大IMA劑量是常用的方法。有研究發(fā)現(xiàn)，IMA劑量增加到600mg/d或800mg/d對30%～50%繼發(fā)性耐藥患者有效，但是持續(xù)時間較短，且往往還會增加不良反應(yīng)的發(fā)生[12-13]，所以該方法的可行性還有待進一步研究。也有研究發(fā)現(xiàn)，對于IMA耐藥可以采用與信號傳導(dǎo)通路的抑制劑聯(lián)用，比如Ras途徑抑制劑、PI3K途徑抑制劑等[14]，但是該類藥物聯(lián)合使用的作用機制未明，臨床推廣需要進一步深入的研究。

細胞自噬是細胞適應(yīng)性生長、分化、凋亡所必須的一種生理現(xiàn)象。在腫瘤組織中，細胞自噬起到雙重作用，一方面細胞自噬可以保護正常細胞，抑制腫瘤細胞的生長，另一方面可以抵制外界環(huán)境對于腫瘤細胞的損傷，進一步促進腫瘤細胞的生長。近年研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤耐藥中，細胞自噬起了關(guān)鍵的作用[15-16]。MYC抑制劑預(yù)處理人前列腺上皮細胞后，對雷帕霉素不敏感，細胞自噬水平降低[17]。急性淋巴細胞白血病細胞會通過自噬對糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生耐藥[18]。而細胞自噬的產(chǎn)生和用藥劑量及用藥時長有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，小劑量的抗腫瘤藥物使用可以使腫瘤細胞迅速啟動自噬，細胞通過自噬清除損傷的細胞器等，從而獲得更好的抗性[19]。

筆者團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，抑制Beclin-1基因的表達可以提高K562/IMA細胞對于IMA的敏感性[20]。這提示，細胞自噬的激活在K562細胞對IMA耐藥中起一定的作用。羥氯喹是一種臨床常用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療藥物。本研究結(jié)果顯示，羥氯喹可以抑制K562/IMA細胞自噬過程中酸性囊泡的產(chǎn)生，抑制自噬流的傳遞。本研究將羥氯喹聯(lián)合IMA作用于K562/IMA細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羥氯喹預(yù)處理后可以顯著提高細胞對于IMA的敏感性，細胞凋亡率增高，同時增殖率下降，相比單用IMA具有明顯差異。IMA處理K562/IMA細胞可以提高LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達。LC3Ⅰ/Ⅱ是自噬激活的標志蛋白，用于自噬體的形成，而使用羥氯喹預(yù)處理后，LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白的表達明顯受抑制。p62是自噬底物蛋白，在自噬發(fā)生后表達降低，而羥氯喹預(yù)處理后可以提高K562/IMA細胞p62表達水平；同時，細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平提高。這可以說明，K562/IMA細胞啟動了凋亡程序，IMA在耐藥株中重新獲得了細胞殺傷的能力。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，羥氯喹可以逆轉(zhuǎn)IMA耐藥的CML K562細胞對IMA的敏感性，其作用機制或與抑制細胞自噬有關(guān)。