呂自力，張恩鵬，郭愛珍，羅斌，梁鑫，單旭東，莊靜，張霞，王亮

1(成都中醫(yī)藥大學 醫(yī)學與生命科學學院，四川 成都,610041) 2(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江,212013)

乳鐵蛋白是一種由哺乳動物黏膜上皮細胞分泌產(chǎn)生的分子質(zhì)量為80 kDa的糖基化蛋白，在不同物種間具有高度的同源性[1]。乳鐵蛋白也是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一員，對鐵離子具有高度的親和性，被認為是人類和哺乳動物防御系統(tǒng)的基本組成之一[2]。乳鐵蛋白肽是乳鐵蛋白在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶消化得到的一種短肽，具有良好的耐熱性、非抗原性、免疫調(diào)節(jié)活性和廣譜抗菌、抗病毒等生物活性[3-5]，目前，已在鼠、山羊、牛、駱駝等動物和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。研究表明，牛乳鐵蛋白肽的抗菌活性更高[6]。

牛乳鐵蛋白肽是從牛乳鐵蛋白N端獲得的長度為25個氨基酸殘基的短肽(N17-41: FKCRR WQWRM KKLGA PSITC VRRAF)，分子質(zhì)量為3 126.4 Da，相對疏水性為48%，電荷數(shù)為+8，在牛乳鐵蛋白分子中呈α-螺旋結(jié)構(gòu)，當從牛乳鐵蛋白分子上釋放出來后，在水分子及鹽離子的作用下，α-螺旋消失，轉(zhuǎn)換為兩親性反向β-折疊結(jié)構(gòu)[7]，即親水性基團和疏水性基團，分別排列在β-折疊兩側(cè)，這種結(jié)構(gòu)上的變化使牛乳鐵蛋白肽具有比牛乳鐵蛋白更高的抗菌活性[8]。有研究表明，在發(fā)揮抑菌作用時，兩親性結(jié)構(gòu)有利于促進牛乳鐵蛋白肽與細菌細胞膜脂多糖的結(jié)合，帶正電荷的氨基酸殘基與帶負電的磷脂發(fā)生靜電相互作用，導致細胞膜穿孔，細胞內(nèi)容物泄漏[9]。不同于傳統(tǒng)抗生素的抑菌機制，牛乳鐵蛋白新型抑菌機制有利于其作為抗生素替代藥物的研發(fā)和應用。由于天然來源有限且制備工藝復雜，因此利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)牛乳鐵蛋白肽已成為一個趨勢。

近年來，研究人員致力于抗菌肽結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究，期望通過對抗菌肽兩親性參數(shù)，凈電荷數(shù)，疏水性參數(shù)的改變獲得具有更高生物活性的衍生肽[10]。EDWARDS等[11]通過對6種β-發(fā)卡型抗菌肽的研究發(fā)現(xiàn)，隨著兩親性的增加，其抗菌活性也逐漸增加。作為一種兩親性陽離子活性肽，牛乳鐵蛋白肽的活性與其兩親性密切相關(guān)。在形成β-折疊時，Phe1，Cys3，Trp6，Trp8，Leu13，Ala15，Pro16，Ile18和Cys20構(gòu)成疏水表面，這對于其發(fā)揮抗菌功能是十分重要的[12]。STR?M等[13]對15個殘基的牛乳鐵蛋白肽進行了丙氨酸掃描實驗，結(jié)果表明Trp6和Trp8是保持其活性的關(guān)鍵氨基酸，當將人乳鐵蛋白肽(LfcinH)第8位Arg替換為Trp后，其抗菌活性明顯提高。LEJON等[14]對牛乳鐵蛋白肽進行了色氨酸替換研究，W3,14和W14都顯示出比母肽更強的抗菌活性，可以看出3、4、10、14等為潛在的替換位點。牛乳鐵蛋白肽作用機制和結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的研究有利于設計得到高活性的衍生肽。

在本研究中，基于抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，利用抗菌肽數(shù)據(jù)庫和生物信息學分析工具設計了LfcinB-W4,10[15-16]。經(jīng)過一系列的比較分析，牛乳鐵蛋白肽第4位Arg和第10位Met被Trp替換后能夠保持與母肽相似的空間結(jié)構(gòu)，其正電荷數(shù)為+7，相較母肽有所降低，疏水殘基比例提高到52%。通過抗菌肽數(shù)據(jù)庫預測其抗菌活性優(yōu)于母肽。將優(yōu)化的LfcinB-W4,10基因插入分泌型表達載體pPIC9K中，線性化后電轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115中，誘導表達后發(fā)現(xiàn)發(fā)酵上清液具有較強的抗菌活性。實驗研究為分析和優(yōu)化牛乳鐵蛋白肽的抗菌活性提供了理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

Gene-Pluser XcellTM電轉(zhuǎn)儀，美國伯樂公司； 1645050型DNA電泳儀，美國伯樂公司；Eppendorf 5418R型高速離心機，德國Eppendorf股份公司；SW-CJ系列超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；QY200型恒溫搖床，上海福馬實驗設備有限公司；LSHZ-300系列恒溫水與培養(yǎng)箱，太倉市強樂實驗設備有限公司；BPMJ-250F系列霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司。大腸桿菌(Eschenchiacoli)DH5α和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923，為本實驗室保藏；巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115及表達質(zhì)粒pPIC9K，Invitrogen公司；遺傳霉素G418，賽默飛世爾科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI，NotI，SacI和T4 DNA連接酶，Invitrogen公司；PCR引物和LfcinB-W4,10基因序列，由上海生工生物工程有限公司合成；基因組提取試劑盒，Qiagen公司。其他試劑均為分析純。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20；YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20；MD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，無氨基酵母氮源13.4，生物素10-4，瓊脂粉20；MM培養(yǎng)基：甲醇50 mL/L，無氨基酵母氮源13.4 g/L，生物素10-4g/L，瓊脂粉20 g/L；BMGY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，無氨基酵母氮源13.4 g/L，生物素10-4g/L，甘油100 mL/L；BMMY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，無氨基酵母氮源13.4 g/L，生物素10-4g/L，甲醇25 mL/L。

2 方法與結(jié)果

2.1 LfcinB-W4,10的基因設計與合成

使用抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD(http://ap s.unmc.edu/AP/)[17]和ExPASy(http://we b.expasy.org/protparam)的預測工具對比分析牛乳鐵蛋白肽和LfcinB-W4,10的物理和化學參數(shù)，包括凈電荷、疏水殘基的比例、分子質(zhì)量、理論等電點、脂肪族指數(shù)和GRAVY(親水性的平均值，親水指數(shù))，結(jié)果如表1所示。相較于牛乳鐵蛋白肽，LfcinB-W4,10的疏水殘基由48%提升至52%，由于Arg的替換，其凈電荷數(shù)由+8降低至+7，這可能有利于在表達過程中降低宿主蛋白酶對目的蛋白的降解。利用同源建模工具SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)[18]模擬牛乳鐵蛋白肽和LfcinB-W4,10的空間結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示，LfcinB-W4,10具有和牛乳鐵蛋白肽相似的二級折疊結(jié)構(gòu)，這使得LfcinB-W4,10依然具備和牛乳鐵蛋白肽類似的生物學功能；通過抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD和CAMP(http://www.cam p.bicni rrh.res.in/index.php#)[19]的預測工具預測LfcinB-W4,10的抗菌活性，如表2所示，結(jié)果顯示，LfcinB-W4,10的各項預測數(shù)據(jù)都高于牛乳鐵蛋白肽，表明LfcinB-W4,10的設計在理論上具有可行性，為實驗研究奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化得到基因序列，在序列兩端添加EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(圖2)，交由生工生物工程有限公司合成。

表1 牛乳鐵蛋白肽及LfcinB-W4,10理化參數(shù)分析

注： GRAVY，Grand average of hydropathicity，親水性指數(shù)。

圖1 牛乳鐵蛋白肽和LfcinB-W4,10空間結(jié)構(gòu)對比

Fig.1 Spatial structure comparison of LfcinB and LfcinB-W4,10

表2 LfcinB及LfcinB-W4,10抗菌活性預測

Table 2 The antimicrobial activity prediction of LfcinB and LfcinB-W4,10

蛋白肽SVMRFDAANNCAMP預測LfcinB0.8420.99450.963AMPAMPLfcinB-W4,100.9580.9950.974AMPAMP

2.2 重組表達載體構(gòu)建

使用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切含有目的基因的擴增質(zhì)粒pUC-SP-LFcinB-W4,10，經(jīng)2.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)，檢測到82 bp的條帶，與目的基因大小一致，目的基因回收后與同樣經(jīng)EcoRⅠ 和NotⅠ 雙酶切的外泌型表達質(zhì)粒pPIC9K使用

圖2 LfcinB-W4,10的基因序列

Fig.2 The gene sequence of LfcinB-W4,10

注：TGG、Trp表示酶切位點

M-DNAmarker；1-目的基因LfcinB-W4,10；2-pUC-SP-LfcinB-W4,10

圖3 pUC-SP-LfcinB-W4,10雙酶切電泳

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of pUC-SP-LfcinB-W4,10

T4 DNA連接酶進行連接，構(gòu)建得到表達載體pPIC9K-LFcinB-W4,10(圖4)。圖4將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α進行擴增，擴增后的表達載體進行雙酶切鑒定，根據(jù)重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的序列分析，當使用AvrⅡ和NdeI進行雙酶切鑒定時，空載質(zhì)粒被切成5 881 bp和3 395 bp的2條DNA電泳條帶，而重組質(zhì)粒由于缺失了AvrⅡ酶切位點只能夠被線性化，電泳時表現(xiàn)為1條條帶(圖5)，結(jié)果與預期相符，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖4 重組表達載體pPIC9K-LFcinB-W4,10構(gòu)建

Fig.4 Construction of recombinant expression vector pPIC9K-LFcinB-W4,10

M-DNAmarker 1-pPIC9K-LfcinB-W4,10；2-pPIC9K

圖5 pPIC9K-LFcinB-W4,10雙酶切鑒定

Fig.5 Dual-Enzyme Digestion of pPIC9K-LFcinB-W4,10

2.3 重組表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母

根據(jù)畢赤酵母表達手冊所述方法制備感受態(tài)畢赤酵母GS115，將已鑒定的陽性重組表達載體pPIC9K-LFcinB-W4,10經(jīng)SacI酶切線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母[20]，將菌液涂布于MD培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2～3 d直至轉(zhuǎn)化子長出。

2.4 高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選及甲醇利用型鑒定

將上一步獲得的pPIC9K-LfcinB-W4,10-GS115轉(zhuǎn)化子涂布于含有漸增濃度(0.5～4.0 mg/mL)G418的YPD瓊脂平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d篩選得到高拷貝轉(zhuǎn)化子。根據(jù)拷貝數(shù)和G418質(zhì)量濃度的關(guān)系[21]，在G418質(zhì)量濃度為2 mg/mL的YPD平板上得到拷貝數(shù)約為8的轉(zhuǎn)化子。

使用無菌牙簽挑取拷貝數(shù)為8的轉(zhuǎn)化子，分別點接種至MM和MD平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d待轉(zhuǎn)化子長出。MM培養(yǎng)基中，甲醇為唯一碳源，MD平板中葡萄糖為唯一碳源。甲醇利用型為Mut+的轉(zhuǎn)化子在2種平板上能夠正常生長，甲醇利用型為Muts的轉(zhuǎn)化子在MD平板上正常生長，在MM平板上生長緩慢。根據(jù)生長速度的快慢，可確定轉(zhuǎn)化子的甲醇利用型。

2.5 高拷貝轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

挑取10個轉(zhuǎn)化子提取酵母基因組DNA并且進行PCR擴增，擴增引物為5′AOX Ⅰ：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′與3′AOXⅠ：GCAAATG GCACTG ACATCC-3′。實驗設置雙蒸水作為空白對照，未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酵母基因組為陰性對照。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如圖6所示, 3號為假陽性轉(zhuǎn)化子，4～12號為陽性轉(zhuǎn)化子，在562 bp處出現(xiàn)含有目的基因的擴增條帶，其中，4～9,11，12號轉(zhuǎn)化子在2.2 k出現(xiàn)甲醇脫氫酶AOX I基因的條帶，其甲醇利用型為Mut+，10號在2.2 k處未出現(xiàn)條帶，其甲醇利用型為Muts。結(jié)果證明，9個轉(zhuǎn)化子成功整合目的基因。

1-空白對照；2-陰性對照；3～12-轉(zhuǎn)化子基因組PCR

圖6 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

Fig.6 Identification by PCR of transformants genome

2.6 LfcinB-W4,10的誘導表達

挑取經(jīng)PCR鑒定為陽性克隆的重組酵母轉(zhuǎn)化子單克隆接入5 mL BMGY培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，隨后接入100 mL BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h至OD600為2～6。然后4 100 r/min離心5 min收集菌體，于250 mL三角瓶中用100 mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，30 ℃，200 r/min振蕩誘導培養(yǎng)，每隔24 h取樣1 mL用于檢測其抑菌活性并補充甲醇，使甲醇終濃度占體積分數(shù)2.5%。

2.7 抑菌活性檢測

采用抑菌圈法檢測LfcinB-W4,10的抑菌活性，將100 μL過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液加入20 mL LB培養(yǎng)基中混勻，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中。待凝固后用已滅菌的打孔器打孔，每孔加入80 μL發(fā)酵上清液，以40 μL氨芐青霉素溶液(100 mg/mL)作為陽性對照，以未轉(zhuǎn)化的酵母發(fā)酵上清液為陰性對照，于37 ℃培養(yǎng)16 h，檢測其抑菌活性。結(jié)果如圖7所示，圖中7-A為40 μL 100 mg/mL的氨芐青霉素作為陽性對照，孔6為 80 μL未轉(zhuǎn)化重組表達載體的畢赤酵母GS115在相同誘導條件下的發(fā)酵上清液作為陰性對照。隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵上清液產(chǎn)生的抑菌圈逐漸增大(圖8)，但是當發(fā)酵時間超過96 h后，抑菌效果有所降低，這可能是因為宿主蛋白酶使目的蛋白發(fā)生了降解。

1-24 h發(fā)酵上清液； 2-48 h發(fā)酵上清液； 3-72 h發(fā)酵上清液；4-96 h發(fā)酵上清液； 5-120 h發(fā)酵上清液；6-未轉(zhuǎn)化目的基因的畢赤酵母GS115發(fā)酵上清液；A-陽性對照

圖7 發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

Fig.7 Antibacterial activity of fermentation broth against Staphylococcus aureus

圖8 不同誘導時間抑菌圈直徑

Fig.8 The diameter of the inhibition zone in different time

把對照的原生肽LFcinB與衍生肽LFcinB-W4,10采用抑菌圈法檢測，如圖9所示，孔1和孔3為原生肽LfcinB，分別加入40 μL和80μL發(fā)酵上清液。孔2和孔4為衍生肽LfcinB-W4,10，也分別加入40 μL和80 μL發(fā)酵上清液。以40 μL氨芐青霉素溶液(100 mg/mL)作為陽性對照，于37 ℃培養(yǎng)16 h，檢測其抑菌活性。結(jié)果顯示，衍生肽的抗菌活性要優(yōu)于原生肽抗菌活性。

孔1～4的抑菌圈直徑分別為15、18、23和25 cm

圖9 LFcinB與LFcinB-W4,10的抑菌活性比較

Fig.9 Compared antibacterial activity between LFcinB and LFcinB-W4,10

2.8 Tricine-SDS-PAGE鑒定

根據(jù)抑菌活性檢測結(jié)果，在誘導培養(yǎng)第96小時，收集發(fā)酵上清液，使用18%含6 mol/L尿素的分離膠Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖10所示，轉(zhuǎn)化子組在3.2 kDa處有1條明顯的條帶，與實驗設計的LfcinB-W4,10氨基酸殘基的短肽相對分子質(zhì)量一致。而空菌在相同條件下的發(fā)酵上清液沒有條帶，表明LfcinB-W4,10在畢赤酵母中有效分泌表達。

M-蛋白marker；1-空菌；2-轉(zhuǎn)化子

圖10 Tricine-SDS-PAGE檢測

Fig.10 The detection of LfcinB-W4,10 by Tricine-SDS-PAGE

3 討論

實驗在綜合分析其他實驗研究的基礎(chǔ)上，對LfcinB基因進行了多位點突變，旨在探究氨基酸殘基的改變對其抗菌活性的影響，對衍生肽和原肽進行理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、抑菌活性的分析，為獲得更高活性的衍生肽奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)畢赤酵母分泌型穿梭表達質(zhì)粒pPIC9K的多克隆位點，在目的基因兩側(cè)添加了EcoRI和NotI的限制性酶切位點，將合成的LfcinB-W4,10基因克隆至表達載體，經(jīng)SacI線性化后電轉(zhuǎn)至畢赤酵母宿主菌GS115中，經(jīng)篩選得到G418高抗性陽性轉(zhuǎn)化子，提取酵母基因組進行PCR鑒定，獲得9株整合成功的陽性轉(zhuǎn)化子且甲醇利用型8株為Mut+，1株為Muts。經(jīng)甲醇誘導后對其抗菌活性進行分析發(fā)現(xiàn)，有1株菌蛋白表達較快，抑菌效果較好，另外8株在誘導72 h后也表現(xiàn)出較強的抑菌活性。誘導表達96 h后，其抑菌活性有所下降，這可能是因為宿主蛋白酶降解異源蛋白造成的[22-23]。在進一步的實驗中，將對培養(yǎng)溫度，甲醇誘導濃度等條件進行優(yōu)化以期獲得大量LfcinB-W4,10。

抗菌肽由于其抗菌原理不同于傳統(tǒng)抗生素，不具有傳統(tǒng)抗生素所具有的抗藥性，這有利于其作為抗生素替代藥物的研發(fā)和應用。天然存在的乳鐵蛋白，來源有限且制備工藝復雜，抗菌活性低，因此利用基因工程技術(shù)生乳鐵蛋白肽已成為一個趨勢。本文從生物信息學分析工具開始，基于抗菌肽結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系設計了LfcinB衍生肽LfcinB-W4,10，實驗結(jié)果表明，抗菌肽LfcinB-W4,10基因已正確整合到酵母基因組，并且獲得表達，衍生肽具有良好的抑菌活性，而酵母發(fā)酵可以大規(guī)模生產(chǎn)目的蛋白，兩者結(jié)合，為大規(guī)模工廠化生產(chǎn)抗菌肽奠定了良好的基礎(chǔ)。