李歆 馮金鑫 楊素冰 劉高杰 張相良

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2腹外科（廣州510095）

胃癌在我國(guó)所有惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率中名列第二位[1]。其預(yù)后差，臨床仍需探索出新的早期診斷方法、預(yù)后指標(biāo)以及尋找有效治療靶點(diǎn)[2]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）通過(guò)多種機(jī)制（如基因印記、染色質(zhì)重塑、細(xì)胞周期調(diào)控、剪接調(diào)控、mRNA降解和翻譯調(diào)控等）在多種層面上（如表觀(guān)遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基因的表達(dá)水平[3]，與蛋白質(zhì)、RNA和DNA相互作用。越來(lái)越多的研究證實(shí)，LncRNA在腫瘤中異常的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可作為雙重調(diào)控因子參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種過(guò)程[4-5]。筆者在前期研究中，通過(guò)應(yīng)用高通量LncRNA表達(dá)譜芯片及定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)RP11-356I2.2在胃癌病人血清中異常表達(dá)，且經(jīng)精準(zhǔn)腹腔熱灌注化療后RP11-356I2.2上調(diào)明顯[6]，但是RP11-356I2.2對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及成瘤的調(diào)控機(jī)制目前尚未完全闡明。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株BGC-823、SGC-7901細(xì)胞中RP11-356I2.2的表達(dá)變化，并過(guò)表達(dá)RP11-356I2.2對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移能力的影響，將轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)RP11-356I2.2質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞SGC-7901/RP11-356I2.2注入裸鼠皮下觀(guān)察SGC-7901/RP11-356I2.2細(xì)胞成瘤能力的改變。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑正常人胃黏膜細(xì)胞株GES-1以及人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、BGC-823均來(lái)自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)。各細(xì)胞系均用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的恒溫孵箱中常規(guī)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)液由美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自于日本Takara公司，RP11-356I2.2質(zhì)粒由上海吉瑪公司提供，Lipofectamin2000、TRIzol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。結(jié)晶紫染液、MTT試劑盒等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)皿、Transwell小室、離心管等一次性耗材購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 胃癌細(xì)胞的RP11-356I2.2表達(dá)水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用Real-Time PCR法檢測(cè)胃黏膜GES-1細(xì)胞和胃癌BGC-823、SGC-7901細(xì)胞中的RP11-356I2.2表達(dá)水平的差異。首先，應(yīng)用Trizol法提取組織和細(xì)胞中的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用TakaraSYBR Premix Ex Taq試劑盒檢測(cè)樣品中RP11-356I2.2及內(nèi)參GAPDH的相對(duì)表達(dá)量，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RP11-356I2.2上游引物序列為：5′-TGCCCATGTCCACCCATAAG-3′，下游引物序列為：5′-TCGGGGACTGGCATTTTCAC-3′；內(nèi)參 GAPDH上游引物序列為：5′-CCATGAGAAGTATGACAAC-3′，下游引物序列為：5′-GAGTCCTTCCACGATACC-3′，以 2-ΔΔCt法表示 RP11-356I2.2 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 RP11-356I2.2對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)節(jié)作用觀(guān)察

1.3.1 分組將胃癌SGC-7901細(xì)胞分為RP11-356I2.2過(guò)表達(dá)組、空質(zhì)粒組，分別轉(zhuǎn)染SGC-7901過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染試劑均應(yīng)用Lipofectamin2000試劑，實(shí)驗(yàn)步驟均按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后37℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.3.2 各組胃癌細(xì)胞增殖能力觀(guān)察MTT法：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μL，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至103～104個(gè)/孔，5%CO2、37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，細(xì)胞貼壁后即可加藥。每組6個(gè)復(fù)孔，每孔加入20 μL的MTT反應(yīng)液，合并加入150 μL二甲基亞砜，為充分溶解結(jié)晶物，將體系置于水平搖床上以最低速振蕩12 min。在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm條件下測(cè)得各孔的OD490。

克隆形成實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化，離心，將轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞以每孔500～800個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，放入孵箱，調(diào)整細(xì)胞密度到103/mL，每3～4 d更換培基，連續(xù)培養(yǎng)2～3周，培養(yǎng)結(jié)束后以純甲醇固定30 min，再以0.1%結(jié)晶紫染液染色20～30 min，最后以清水漂洗干凈，倒置晾干后取照，將培養(yǎng)板置于顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.3.3 各組胃癌細(xì)胞遷移能力觀(guān)察Transwell小室實(shí)驗(yàn)：先讓細(xì)胞撤血清饑餓12～24 h，去除血清的影響。應(yīng)用胰酶消化細(xì)胞，含血清培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌1至2遍，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。利用計(jì)數(shù)儀調(diào)整細(xì)胞密度至105～106個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液100～200 μL加入Transwell小室。將小室置入預(yù)先添加有500 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng) 24 h。無(wú)菌棉簽輕柔拭去小室內(nèi)表面細(xì)胞，純甲醇固定濾膜20～30 min。固定結(jié)束，以0.1%結(jié)晶紫染色25 min，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞總數(shù)。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染后24 h，在各組細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)用10 μL Tip頭劃3～5條均勻的平行線(xiàn)，定期更換含1%FBS的培養(yǎng)基，連續(xù)定期監(jiān)測(cè)48 h，測(cè)算劃痕愈合率。

1.4 RP11-356I2.2構(gòu)建及成瘤觀(guān)察

1.4.1 RP11-356I2.2構(gòu)建（1）胃癌細(xì)胞株SGC7901在無(wú)菌條件下培養(yǎng)至狀態(tài)良好；（2）轉(zhuǎn)染前，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用胰酶消化，并接種六孔板中培養(yǎng)；（3）A液：無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋RP11-356I2.2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及空質(zhì)粒；B液：無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Lipofecta-

min2000轉(zhuǎn)染劑；（4）A液、B液室溫下各自孵育5 min后，將A液和B液混勻并孵育15 min，即配置成含有RP11-356I2.2過(guò)表達(dá)及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑；（5）當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)50%時(shí)，用六孔板PBS漂洗2～3遍，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，同時(shí)分別加入含有RP11-356I2.2過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)染劑及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑，輕搖后置入培養(yǎng)箱；（6）6 h后將含有Lipofectamin2000的培養(yǎng)基洗去，更換新培基；（7）轉(zhuǎn)染72 h后，行效果監(jiān)測(cè)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 RP11-356I2.2成瘤觀(guān)察取20只約5周齡的雌性裸鼠，并隨機(jī)均等分為RP11-356I2.2對(duì)照組及過(guò)表達(dá)組，每組10只裸鼠，分別在其背部皮下注射轉(zhuǎn)染處理后24 h的RP11-356I2.2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞和空質(zhì)粒組細(xì)胞約1.5×106個(gè)，3周后處死小鼠，并測(cè)量腫瘤體積和質(zhì)量。計(jì)算體積（V）公式：V=（L×W2）/2，其中 L是腫瘤的最大徑線(xiàn)長(zhǎng)度，W是腫瘤的最大寬度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)應(yīng)用GraphPad Prism 6和SPSS 20.0軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間應(yīng)用方差分析以及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BGC-823、SGC-7901、GES-1細(xì)胞中RP11-356I2.2相對(duì)表達(dá)量比較 BGC-823、SGC-7901細(xì)胞中RP11-356I2.2的相對(duì)表達(dá)水平分別是GES-1的（0.45±0.22）、（0.37±0.25）倍，相對(duì)表達(dá)水平均顯著低于GES-1細(xì)胞（P＜0.05）。

2.2 各組胃癌細(xì)胞增殖能力比較各組別胃癌SGC-7901/RP11-356I2.2的細(xì)胞OD490以及克隆形成總數(shù)見(jiàn)表1，RP11-356I2.2過(guò)表達(dá)組的OD490值、克隆形成數(shù)均低于空質(zhì)粒組（P＜0.05）。

表1 各組胃癌BGC-823、SGC-7901細(xì)胞OD490值和克隆形成數(shù)比較Tab.1 Comparison of OD490value and cloning number of BGC-823 and SGC-7901 cells in each group ±s

表1 各組胃癌BGC-823、SGC-7901細(xì)胞OD490值和克隆形成數(shù)比較Tab.1 Comparison of OD490value and cloning number of BGC-823 and SGC-7901 cells in each group ±s

注：與siRNA對(duì)照序列組相比，*P＜0.05；與空質(zhì)粒組相比，#P＜0.05

組別RP11-356I2.2siRNA組siRNA對(duì)照序列組RP11-356I2.2過(guò)表達(dá)組空質(zhì)粒組OD490 BGC-823細(xì)胞0.86±0.08*1.22±0.05 0.69±0.06#1.44±0.03 SGC-7901細(xì)胞1.39±0.25*1.89±0.10 1.13±0.04#1.74±0.06克隆數(shù)（個(gè)）BGC-823細(xì)胞109.76±9.50*302.51±11.74 83.20±21.33#141.00±11.51 SGC-7901細(xì)胞124.67±12.79*284.33±13.50 71.78±23.54#118.02±14.98

2.3 各組胃癌細(xì)胞遷移能力比較RP11-356I2.2過(guò)表達(dá)組SGC-7901細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)低于空質(zhì)粒組[（241.16 ± 7.95）vs.（433.41 ± 13.71），P＜ 0.01，圖1-2]。RP11-356I2.2/SGC-7901及空質(zhì)粒/SGC-7901細(xì)胞劃痕愈合率分別為（17.67±1.53）% 、（62.67±2.52）%，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

2.4 RP11-356I2.2過(guò)表達(dá)組、對(duì)照組裸鼠腫瘤體積及質(zhì)量的比較SGC-7901/RP11-356I2.2組裸鼠腫瘤體積、小于對(duì)照組裸鼠腫瘤體積分別為[（322.61± 161.53）mm3vs.（718.30 ± 246.43）mm3，P=0.017]，見(jiàn)圖4A、B；SGC-7901/RP11-356I2.2組裸鼠腫瘤質(zhì)量亦小于對(duì)照組[（0.42± 0.22）mgvs.（0.88±0.36）mg，P=0.041]，見(jiàn)圖4C）。

3 討論

胃癌在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率近幾年均居高不下，并有緩慢上升的趨勢(shì)[7]，臨床上缺乏有效的早期篩選生物標(biāo)記物，胃癌患者的總體預(yù)后較差，若出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率低于10%。

圖1 Transwell小室實(shí)驗(yàn)（顯微鏡下觀(guān)察遷移至下室細(xì)胞，200×）Fig.1 TranswellChamber experiment（microscopically，the cells migrated to the lower ventricle with a magnification of 200×）

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)（任意選擇9個(gè)高倍鏡視野，統(tǒng)計(jì)侵襲遷移至下室細(xì)胞數(shù)目）Fig.2 Transwell experiment（Select 9 high power microscopic fields randomly and count the number of invasive cells migrating to the lower ventricle）

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)RP11-356I2.2對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 Scratch assay was used to detect the effect of overexpression of RP11-356I2.2 on migration of gastric cancer cells

圖4 裸鼠動(dòng)物模型Fig.4 Nude mice model

既往諸多研究揭示，LncRNA幾乎全程參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。其中包含腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、增殖凋亡、自噬、多藥耐藥及預(yù)后等多個(gè)過(guò)程[8-11]。例如，有學(xué)者證實(shí)LncRNA DGCR5在胃癌組織和胃癌患者血漿樣本中下調(diào)，其下調(diào)與晚期TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性有關(guān)，DGCR5過(guò)表達(dá)可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，抑制miR-23b和增殖抗原Ki-67的表達(dá)，同時(shí)調(diào)控PTEN和BTG1在體內(nèi)的表達(dá)[12]。JIN等[13]研究表明，Lnc00165在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，Lnc00165的高表達(dá)與胃癌的腫瘤結(jié)節(jié)浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移分期和總生存期存有密切關(guān)系。功能實(shí)驗(yàn)表明，Lnc00165基因的下調(diào)抑制了GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，Lnc00165基因的過(guò)表達(dá)刺激了GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；在機(jī)制上，Lnc00165可促進(jìn)GC細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。ZHANG等[14]研究表明LncRNA HOXC-AS3在體外和體內(nèi)均可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移，RNA下拉質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)YBX1與HOXC-AS3相互作用，RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)YBX1敲除后差異表達(dá)的基因與HOXC-AS3轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因明顯重疊，說(shuō)明YBX1參與了HOXC-AS3介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在胃癌細(xì)胞系中LncRNA H19可通過(guò)H19/miR-675/FADD/caspase 8/caspase 3通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]。此外，LIU 等[16]研究表明，RUNX1的引入抑制了H19/miR-675誘導(dǎo)的Akt/mTOR通路激活，以及隨后AGS細(xì)胞的增殖和侵襲，RUNX1作為H19/miR-675軸與Akt/mTOR信號(hào)通路之間的鏈接，是H19/miR-675誘導(dǎo)胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵中介因子。

LncRNA水平的異常表達(dá)與多種人類(lèi)疾病包括癌癥有關(guān)，可通過(guò)DNA或組蛋白甲基化、染色質(zhì)重塑，從而改變基因的表達(dá)。還具有吸附miRNA的海綿功能[17-18]。LncRNA在調(diào)控組織分化的重要機(jī)制已取得大量研究成果，其在胃癌及結(jié)直腸癌中的作用也逐漸被揭曉。目前仍存在爭(zhēng)議的是，其在腫瘤中究竟發(fā)揮促進(jìn)亦或抑制的作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中RP11-356I2.2顯著低于正常胃黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)水平，這與筆者前期研究中利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行胃癌相關(guān)基因分析得出的RP11-356I2.2是胃癌相關(guān)抑癌基因的結(jié)論一致。采用胃癌SGC-7901細(xì)胞系過(guò)表達(dá)RP11-356I2.2，能顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲遷移能力。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，注入穩(wěn)定表達(dá)SGC-7901/RP11-356I2.2細(xì)胞系后，裸鼠體內(nèi)裸鼠成瘤能力顯著減弱。其證實(shí)RP11-356I2.2在調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移、成瘤能力等各方面均具有重要作用，初步闡明RP11-356I2.2在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。以上研究結(jié)果提示，RP11-356I2.2參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可作為胃癌早期診斷和評(píng)判胃癌預(yù)后的重要潛在分子標(biāo)志物。但是，其調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯的作用，通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮此作用，以及介導(dǎo)上游因子的調(diào)控機(jī)制，都有待更進(jìn)一步的研究。