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        急性髓系白血病SPRED1基因啟動子甲基化狀態(tài)的研究

        2019-08-24 05:55:34孫精文張蕊李艷
        關(guān)鍵詞:水平研究

        孫精文,張蕊,李艷

        (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科,沈陽 110001)

        急性髓系白血病 (acute myeloid leukemia,AML)是一組以造血干細胞增殖失控,分化受阻,同時抑制正常造血為特點的異質(zhì)性造血系統(tǒng)惡性疾病。近年來,隨著基因組研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)的修飾作用,如DNA甲基化狀態(tài)的改變,特別是抑癌基因啟動子的甲基化,引起抑癌基因沉默,是影響白血病發(fā)生和發(fā)展的重要分子機制[1]。表觀遺傳修飾是指不涉及DNA序列改變的一種可逆的、動態(tài)的及可隨細胞分裂而遺傳的基因調(diào)節(jié)方法[2]。DNA甲基化是目前表觀遺傳學(xué)最主要及常見的基因轉(zhuǎn)錄前調(diào)控機制[3-4],出現(xiàn)在不同的疾病中,如膠質(zhì)母細胞瘤[5]、淋巴細胞白血?。?]和AML[7]。已有文獻[8]中,大約50%的AML患者缺乏細胞遺傳學(xué)異常,處于中度風(fēng)險組,而很大比例的患者攜帶未知AML相關(guān)調(diào)控基因[9-10]。因此,關(guān)于AML的發(fā)生和發(fā)展機制,表觀遺傳學(xué)修飾機制比只用體內(nèi)突變來解釋更合理。

        Ras/MAPK信號通路已被證實參與AML的發(fā)病機 制, SPRED1 (human sprout-related EVH1 domaincontaining 1) 是 參 與 調(diào) 控AML Ras/MAPK信 號 通路的抑癌基因[11-12]。SPRED1于2001年由YOSHIMURA等[13]在鼠的破骨細胞cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)。SPRED1位于染色體15q13.2,編碼含有444個氨基酸的蛋白質(zhì),具有3個功能域,即N端的EVH1域、中間的c-kit結(jié)合域和C端的SPRY相關(guān)域,與SPRED2、SPRED3同屬于SPRED家族[14]。人類SPRED1在肺、腦、脊髓、腎臟和乳腺中高表達,在肝、胰腺、前列腺、甲狀腺、肌肉、骨骼、骨髓中表達相對較低[15-17]。SPRED1與神經(jīng)纖維蛋白1 (protein-neurofibromin,NF1) 相互作用,下調(diào)Ras/MAPK信號通路[14]。在肝細胞癌、前列腺癌和淋巴瘤中,SPRED1可抑制Ras/MAPK信號通路和惡性細胞轉(zhuǎn)移。另外,SPRED1已被證實在兒童急性白血病中下調(diào),是Ras/MAPK信號通路的抑癌基因[12]。然而SPRED1的下調(diào)機制目前仍未知。研究[18]發(fā)現(xiàn),伴有SPRED1突變者具有白血病傾向,但后續(xù)研究[12,19]表明,SPRED1突變和缺失在AML并不常見。本研究擬探討AML患者SPRED1的表觀遺傳學(xué)狀態(tài),分析其與SPRED1 mRNA水平和預(yù)后參數(shù)的相關(guān)性。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 研究對象:選擇2015年10月至2017年6月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院的AML患者共50例 (病例組) ,其中,男27例,女23例,年齡16~80歲 (中位年齡45歲)。所有患者依據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織AML分型標(biāo)準(zhǔn)[20]進行診斷、分型。對照組為20例健康志愿者,年齡18~75歲 (中位年齡54歲)。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn) (#AFSOP-07-1.0-01) 以及研究對象和家屬的知情同意。

        1.1.2 主要試劑:AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒[康寧生命科學(xué) (吳江) 有限公司]; M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒 (美國Promega公司);Trizol試劑盒、SYBR GREEN試劑盒、單鏈cDNA合成試劑盒 (日本TaKaRa公司);EZ DNA Methylation-Gold Kit、熱啟動的DNA聚合酶 (美國Zymo公司)。

        1.1.3 主要儀器:NanoDropTM 2000分光光度計 (美國Thermo公司);PCR儀 (7500,美國ABI公司);K960熱循環(huán)儀 (杭州晶格科學(xué)儀器有限公司);低溫高速離心機 (德國Eppendorf公司);MassARRAY平臺 (美國Sequenom公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 RNA的提取及實時熒光定量PCR:抽取骨髓樣本,用Trizol試劑盒從骨髓樣本的單個核細胞中提取RNA,紫外分光光度儀檢測A260/A280均為1.8~2.0,以確定其濃度與純度。用單鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。行實時定量PCR,β-actin為內(nèi)參照基因。PCR引物由Invitrogen公司合成,SPRED1正義引物序列為5'-GATGAGCG AGAGACGGAGAC-3',反義引物序列為5'-GTCTCT GAGTCTCTCCACGGA-3';β-actin正 義 引 物 序 列為5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3',反義引物序列為5'-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3'。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40個循環(huán);95 ℃15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。隨后進行熔解曲線的獲取和分析,以確定PCR反應(yīng)的特異性。SPRED1的相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

        1.2.2 DNA的提取及甲基化定量PCR:用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒從骨髓樣本的單個核細胞中提取DNA,紫外分光光度儀檢測A260/A280均為1.8~2.0。所有DNA立即硫化修飾處理或-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照EZ DNA Methylation Kit說明書,對抽提的DNA進行亞硫酸氫鹽處理,在MassARRAY平臺進行DNA甲基化的定量檢測。應(yīng)用Sequenom EpiDesigner software (www.epidesigner.com) 設(shè)計引物,正義引物序列為5'-AGGATAATGTTGTTGTTGAGGTAGGagga agagag-3',反義引物序列為5'-CTAAATCCCAAATA CTCCCAAATTCcagtaatacgactcactatagggagaaggct-3'。反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min;94 ℃ 20 s,64 ℃ 30 s,72 ℃1 min,40個循環(huán);72 ℃ 5 min。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

        采用 SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism軟件 (version 5.0,美國GraphPad Software公司) 進行統(tǒng)計分析及數(shù)據(jù)繪圖。采用Mann-Whitney檢驗評估病例組與對照組之間的SPRED1基因啟動子甲基化差異,采用Spearman相關(guān)系數(shù)r評估SPRED1基因啟動子甲基化狀態(tài)與mRNA水平和預(yù)后參數(shù)之間的相關(guān)性。所有檢驗均設(shè)定為雙側(cè)檢驗,P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平顯著升高

        SPRED1基因 (#1:310-723 bp) 包含12個CpG位點 (圖1A),用Sequenom MassARRAY平臺分析50例AML患者和20例健康對照的甲基化水平。分析之前,進行嚴格的質(zhì)量控制,刪除潛在的不可靠的測量數(shù)據(jù)[21],包括少于30%的樣本檢測到的CpG位點(unreliable CpG units) 和丟失數(shù)據(jù)超過30%的樣本(unreliable samples),最后所獲得的有效CpG位點為9個。

        #1_CpG_1在AML患者中的甲基化水平 (86.94%±8.61%) 明顯高于健康對照組 (82.70%±2.85%,P <0.01);#1_CpG_2在AML患者中的甲基化水平 (86.18%±29.40%) 明顯高于健康對照組 (80.90%±28.98%,P = 0.031);#1_CpG_11在AML患者中的甲基化水平(88.68%±15.38%) 高于健康對照組 (86.00%±7.71%,P = 0.039,圖1B),其他位點在AML病例組和健康對照組中均無統(tǒng)計學(xué)差異 (P > 0.05)。

        圖1 AML患者與健康對照組SPRED1啟動子甲基化水平的比較Fig.1 Comparison of SPRED1 gene promoter methylation levels between control individuals and patients with AML

        2.2 AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平與SPRED1 mRNA表達水平呈負相關(guān)

        AML患者的SPRED1 mRNA水平 (0.92±2.73) 明顯低于健康對照組 (1.77±4.79,P < 0.01)。在AML患者中,#1_CpG_11甲基化水平與SPRED1 mRNA表達水平呈負相關(guān) (r = -0.427,P = 0.004) (圖2A);#1_CpG_2、#1_CpG_1甲基化水平與SPRED1 mRNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性 (r = -0.033,P = 0.822;r = -0.005,P =0.972) (圖2B、2C)。

        2.3 SPRED1基因啟動子甲基化水平與AML患者的預(yù)后參數(shù)缺乏相關(guān)性

        圖2 AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平與SPRED1 mRNA水平的相關(guān)性Fig.2 Correlation between SPRED1 gene promoter methylation level and SPRED1 mRNA expression level in AML patients

        分析SPRED1#1_CpG_11甲基化水平與一系列AML患者預(yù)后相關(guān)的臨床和實驗室檢查參數(shù)之間的關(guān)系,包括年齡、性別、French-American-British(FAB) 分型、白細胞(white blood cell,WBC)數(shù)、血紅蛋白 (hemoglobin,Hb) 含量、血小板 (platelet,PLT)數(shù)、骨髓原始細胞數(shù)、染色體核型和基因突變,發(fā)現(xiàn)#1_CpG_11甲基化水平與上述預(yù)后參數(shù)之間均無相關(guān)性 (P > 0.05)。依據(jù)2017年第3版AML美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) (national comprehensive cancer network,NCCN) 指南,基于細胞遺傳學(xué)和分子學(xué)異常,AML風(fēng)險分層為低危、中危和高危3組,本研究結(jié)果表明低危組、中危組和高危組之間的SPRED1基因啟動子甲基化水平無統(tǒng)計學(xué)差異 (P > 0.05),見表1。

        根據(jù)在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用,突變基因分為FLT3和c-KIT (促進增殖),CEBPA (減少分化),NPM1 (參與細胞周期調(diào)控) 以及DNMT3A、TET2和IDH1/2 (調(diào)控表觀遺傳學(xué)) 4類。50例AML患者中,46例發(fā)生了基因突變,其中,F(xiàn)LT3-ITD突變15例,c-KIT突變8例,CEBPA突變8例,NPM1突變9例,DNMT3A突變9例,TET2突變24例,IDH1/2突變17例。本研究顯示,#1_CpG_11甲基化水平與上述預(yù)后相關(guān)突變基因之間均無相關(guān)性 (P > 0.05)。

        3 討論

        表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,主要包括染色體重塑、組蛋白修飾、DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)控等。DNA甲基化在真核細胞中是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制,已被廣泛研究[22]。Sequenom MassARRAY 平臺具有高度的準(zhǔn)確性、敏感性和高通量,是近幾年新興的基因甲基化定量檢測方法。MassARRAY系統(tǒng)相比亞硫酸鹽測序PCR (bisulfite sequencing PCR,BSP) 能更真實地反映低甲基化區(qū)域的甲基化水平,最低可以檢測到5%[23],因此也更能準(zhǔn)確地反映與基因表達水平之間的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示,AML患者SPRED1基因啟動子甲基化水平增高,且與SPRED1 mRNA水平呈負相關(guān),表明SPRED1基因啟動子甲基化狀態(tài)的改變可能影響其表達并促進白血病的發(fā)生與發(fā)展。本研究證實了抑癌基因SPRED1啟動子甲基化水平在AML患者中明顯增高,同時SPRED1基因表觀沉默。真核生物啟動子區(qū)域包括2部分,一是核心啟動子區(qū),具備結(jié)合、控制轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物的裝配、定位轉(zhuǎn)錄起始點、控制轉(zhuǎn)錄方向和響應(yīng)胞內(nèi)激活子或抑制子等功能,二是上游序列區(qū),決定基因轉(zhuǎn)錄的特異性、活性和效率,確保精準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄。啟動子區(qū)元件構(gòu)成及其功能對于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控至關(guān)重要,因此筆者推測這可能是SPRED1基因不同位點甲基化水平與基因表達的相關(guān)性存在差異的原因,有待進一步研究。有研究[24]發(fā)現(xiàn),SPRED1基因的表達水平與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率呈負相關(guān)。體內(nèi)外研究[25-26]也發(fā)現(xiàn),SPRED1基因高表達可通過抑制制細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases,ERK) 的激活有效抑制腫瘤細胞。在兒童AML中已證實SPRED1基因表達的下調(diào)與Ras/MAPK通路的激活有關(guān)[12]。因此,推測SPRED1基因啟動子高甲基化狀態(tài)引起基因表達水平降低,促進Ras/MAPK通路激活,從而導(dǎo)致白血病的發(fā)生。

        AML的發(fā)生發(fā)展與甲基化調(diào)控基因,如DNMT3A、TET2及IDH1/2的突變密切相關(guān)。DNMT3A是AML細胞DNA甲基化的重要介質(zhì),與不良預(yù)后密切相關(guān)[9,27]。IDH1/2和TET2突變與導(dǎo)致基因組高甲基化相關(guān)[27-28]。有研究[12]發(fā)現(xiàn),F(xiàn)LT3突變與SPRED1基因低表達密切相關(guān)。CEBPA基因編碼一種造血干細胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[29],其突變與AML患者的良好預(yù)后密切相關(guān)[19]。在本研究中,未發(fā)現(xiàn)SPRED1基因啟動子甲基化狀態(tài)與突變基因之間的關(guān)系具有統(tǒng)計學(xué)意義,考慮可能是由于樣本量不足所致。未來還需研究SPRED1甲基化狀態(tài)與治療反應(yīng)和預(yù)后的關(guān)系,全面了解SPRED1高甲基化狀態(tài)在AML發(fā)生發(fā)展中的作用。

        表1 AML患者的臨床特征和SPRED1基因啟動子甲基化水平Tab.1 Clinical characteristics and SPRED1 gene promoter methylation in patients with AML

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