林芝源，吳圻榮，李 灝，彭彩霞

(茂名市職業(yè)病防治院，廣東茂名 525011)

表面活性劑有多種功能，應用廣泛。某些表面活性劑能使血液細胞發(fā)生裂解，具有溶血作用，在醫(yī)學檢驗中常用來配制溶血劑或清洗劑[1]。國內(nèi)關于表面活性劑溶血能力的研究報道較少，曾有學者用鴨血來做實驗樣本的溶血研究[2]，但人與動物的紅細胞(RBC)有差異。微核測試是遺傳毒理學檢測方法，是評價輻射損傷的指標之一，微核制片過程須除去RBC，對溶血劑的選擇還是一大難題，目前采用的KCl低滲溶血法[3]，其溶血時間長，溶血程度較難把握，影響結(jié)果的準確性。本文采用人外周血液為實驗樣本，探討了陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)、非離子表面活性劑辛基苯基聚氧乙烯醚(TritonX-100)、乳化劑辛基苯酚聚氧乙烯(10)醚(OP-10)等的溶血特性，對選擇表面活性劑CTAB用于微核制片的作用機制進行了研究，為臨床應用溶血試驗以及提高微核制片的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 來自職業(yè)體檢的參檢人員，靜脈抽血，EDTA-K2抗凝，通過體檢結(jié)果查詢RBC各項數(shù)據(jù)，選取MCV在85～97 fl之間、Hb在120～168 g/L之間的新鮮血液。另外，選擇MCV分別為：98.1，92.3，86.2，79.8，73.5，67.5和61.7 fl的血液樣本7例，每例樣本一分為二，其中一份作為對照組。

1.2 儀器和試劑 721分光光度計(上海精密儀器有限公司)，光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。CTAB(山東濟寧化工研究所，AR)；SDS(廣州市中南化工儀器有限公司，AR)；TritonX-100(博美生物科技有限公司，進口分裝，純度>99.0%)；OP-10(天津市北聯(lián)精細化工有限公司，CP)。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本處理：抗凝血液用生理鹽水1∶4稀釋洗滌2次(對照組除外)，按比容配制成一定濃度的RBC懸液(v/v)。

1.3.2 試劑配制：稱量一定重量的表面活性劑，用熱蒸餾水溶解后配制成20 g/L的原液，再用生理鹽水稀釋為應用液。

1.3.3 溶血試驗：等滲條件下，紅細胞懸液與表面活性劑溶液混合，溶血15 min，離心吸取上清液稀釋一定的倍數(shù)，于540 nm波長比色，用吸光度(A)來比較溶血程度。溶血能力比較試驗：50%(v/v)RBC懸液0.50 ml與2.0 g/L表面活性劑溶液0.2 ml混合，重復3次；溶血敏感度比較試驗：3.0%(v/v)RBC懸液與不同濃度的表面活性劑溶液等體積混合(混合液最終濃度為原液的1/2)，觀察5s～10s內(nèi)完全溶血時(懸液透明)所需表面活性劑的最低濃度，重復5次；懸液RBC含量對溶血能力的影響試驗：RBC懸液倍比稀釋成7個梯度(50.00%，25.00%，12.50%，6.25%，3.12%，1.56%和0.78%)，分別取0.50 ml與1.0 g/L的表面活性劑溶液0.15 ml混合，重復3次；MCV大小、RBC洗滌與否對溶血能力的影響試驗：7例MCV不同的樣本，洗滌組和對照組(未洗滌)同時配成25% RBC懸液，分別取1.00 ml與1.0 g/L的CTAB 溶液0.20 ml混合，重復3次。

1.3.4 白細胞形態(tài)改變的觀察與判斷標準：取濃度分別為0.1，0.5和1.0 g/L的CTAB溶液與3%(v/v)RBC懸液等體積混合(混合液最終濃度為原液的1/2)，完全溶血后(約10 s)用顯微鏡觀察白細胞形態(tài)的變化，重復5次。判斷標準：白細胞形態(tài)完整，胞膜圓滑(-)；出現(xiàn)胞漿膨出或胞膜陷入的細胞(±)；胞漿膨出或胞膜陷入的細胞占20%以上(+)；見到胞漿消失的裸核(++)；裸核占20%以上(+++)。

1.4 統(tǒng)計學分析 利用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 溶血能力比較 4種表面活性劑CTAB，SDS，TritonX-100和OP-10的溶血結(jié)果(相對A值)分別為：0.635，0.382，0.205和0.198，溶血能力強弱依次為：CTAB>SDS>TritonX-100>OP-10。

2.2 溶血敏感度比較 10 s內(nèi)完全溶解1.5%(v/v)RBC懸液時，混合液所需各種表面活性劑的最低濃度分別為CTAB：0.05 g/L，SDS：0.08 g/L，TritonX-100：0.14 g/L和OP-10：0.15 g/L。

2.3 RBC含量對溶血能力的影響 結(jié)果見表1。RBC濃度由低到高，4種表面活性劑的吸光度(相對A值)在一定范圍內(nèi)與RBC濃度呈正比，當溶血不完全時，隨著RBC含量的增加而降低，溶血程度曲線表現(xiàn)為兩邊低中間高的峰形。

表1 RBC含量對溶血能力的影響(相對A值)(n=3)

2.4 MCV大小、RBC洗滌對溶血能力的影響 結(jié)果見表2。對照組吸光度(相對A值)低于洗滌組，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.366，P=0.018)；兩組的吸光度(A值)都隨著MCV的減小而降低。

表2 MCV大小、RBC洗滌對溶血能力的影響(相對A值)(n=3)

2.5 CTAB對白細胞形態(tài)的影響 結(jié)果見表3。在0.05 g/L CTAB混合液中，RBC溶解后白細胞(粒細胞和淋巴細胞)胞漿仍保持完整，60 s出現(xiàn)胞漿膨出或胞膜陷入的不規(guī)則形狀，300 s后或CTAB濃度增大時，可見到胞漿消失的裸核。

表3 CTAB對白細胞形態(tài)的影響(n=5)

3 討論

3.1 目前，表面活性劑溶血機理尚未清楚，一般認為是表面活性劑對細胞膜上的脂類有特殊作用，能使細胞膜發(fā)生變化，低濃度時可改變細胞膜的結(jié)構，提高細胞膜的滲透性，使細胞吸水后膨脹破裂而導致溶血；當濃度高達一定范圍時，表面活性劑在細胞膜上達到飽和，使細胞膜發(fā)生溶解導致溶血[4]。另一方面，細胞膜表面的脂蛋白對表面活性劑有淬滅作用，膜表面的脂蛋白越多，表面活性劑對細胞膜的破壞作用越弱[5]。

本課題用人外周血液探討了各種表面活性劑的溶血特性，研究發(fā)現(xiàn)，陽離子表面活性劑CTAB的溶血能力最強，這與文獻[2]報道的TritonX-100溶血能力最強、SDS溶血能力大于CTAB的結(jié)果不相符，這是否為試驗方法或是試驗材料的差異，有待以后深入研究。本研究結(jié)果顯示，當溶解液中RBC過剩時，溶血程度隨著RBC含量的增加而降低，可能是紅細胞膜表面的脂蛋白對表面活性劑有淬滅作用，出現(xiàn)抗溶血作用的緣故，因為RBC含量越多，膜表面積越大，脂蛋白含量越多。此外，本研究結(jié)果還顯示，RBC濃度(v/v)一定時，溶血程度隨著MCV的減小而降低，也可能與紅細胞膜表面積比例增大有關，因為相同比容的懸液，RBC體積越小，其含細胞數(shù)越多，膜表面積也越大。這些研究結(jié)果提示紅細胞膜對表面活性劑有一定的抗溶血作用，一定濃度的混合液紅細胞膜表面積越大，溶血程度越低。另外，本研究結(jié)果還顯示，未洗滌RBC懸液其溶血程度低于洗滌組(P<0.02)，可能是未洗滌RBC懸液含有較多的血漿，血漿中的脂質(zhì)或蛋白質(zhì)等成分消耗了部分表面活性劑的緣故。這表明血漿對表面活性劑有一定的降溶血作用。

本實驗表3結(jié)果顯示，在0.05 g/L CTAB溶解液中，紅細胞溶解后，白細胞胞漿仍保持一定的時間，最后才變?yōu)槁愫?。這表明，在低濃度的CTAB溶解液中，CTAB對紅細胞膜的破壞作用較白細胞強。

3.2 微核制片過程的主要步驟是除去紅細胞，獲得足夠數(shù)量的淋巴細胞，如何去除紅細胞而又保證淋巴細胞的完整是微核制片的關健[6]，因此，微核制片所用的溶血劑必須具有對紅細胞的破壞作用較淋巴細胞強、或者選擇性地破壞紅細胞的功能。本研究結(jié)果表明，低濃度的CTAB溶液具有對紅細胞的破壞作用較淋巴細胞強的特性，適用于微核制片。這是由于紅細胞膜與淋巴細胞膜的結(jié)構和成份比例有差異[7]，對表面活性劑的敏感性不同，可以作如下解釋：①紅細胞表面帶負電荷，易與陽離子表面活性劑CTAB通過靜電作用吸附于其表面[8]，加速其溶解過程。②低濃度的表面活性劑能改變細胞膜的滲透性，使細胞吸水膨脹，而紅細胞膜結(jié)構簡單，對膨脹的耐受能力較差，易破裂。③脂蛋白對表面活性劑有淬滅作用，在各種細胞中，紅細胞膜表面含脂蛋白最少[5]，在同一溶解液中比其他細胞先溶解。④隨著RBC的溶解，CTAB本身被消耗，使其在溶液中的游離濃度逐漸降低，隨后減弱了溶解液對淋巴細胞的破壞作用。因此，在合適的CTAB濃度和一定的溶血時間內(nèi)，能使紅細胞完全溶解，而淋巴細胞維持原有體積狀態(tài)，然后經(jīng)固定劑固定，使胞漿得以保留[9]?？梢姡帽砻婊钚詣〤TAB溶血除去紅細胞，與常規(guī)低滲法相比較，更容易獲得胞漿完整的淋巴細胞。

綜上所述，表面活性劑溶血能力與RBC含量、MCV大小、RBC洗滌與否等有關，陽離子表面活性劑CTAB的溶血能力最強，對紅細胞的破壞作用較各種白細胞強，是分離血液淋巴細胞的較理想溶血劑，但是，如果濃度過高或溶血時間過長，超出了其承受的限度，細胞膜也會受損甚至成為裸核，因此，掌握表面活性劑的溶血特性，調(diào)試合適的濃度比例和溶血時間，是獲得高質(zhì)量微核制片的關鍵。