岳芳芳，倪文娟，冷小敏，劉 云，師晶晶，曹東東，郭明好，馬東紅

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院a.腎臟病醫(yī)院腎臟免疫研究所；b.生命科學研究中心，河南衛(wèi)輝 453100)

白介素10(interleukin-10，IL-10)是目前公認的抗炎與免疫抑制因子，它主要由Th2細胞、調節(jié)性T細胞和單核/巨噬細胞產(chǎn)生，在炎癥疾病、自身免疫性疾病、器官移植、血液疾病及癌癥中具有重要價值，參與炎性反應和免疫反應[1]。研究表明IL-10參與糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)生，其可能成為DN治療的新靶點之一。而既往關于IL-10在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)或DN中表達水平的研究得出了相矛盾的結論[2-5]，為進一步明確IL-10在DN患者中的表達水平，我們有必要建立一種穩(wěn)定、靈敏的檢測方法。本研究主要從模板濃度、引物篩選兩方面優(yōu)化IL-10 RNA熒光定量技術，并進一步對IL-10在DN組及對照組中的表達水平進行批量對比，為DN發(fā)病機制的進一步研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1 研究對象 DN組：選取2017年8月～2018年5月于新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎病科及內分泌科住院的33例DN患者，其中DNⅢ期患者11例，平均年齡58.91±10.50歲；DNⅣ期患者22例，平均年齡57.55±10.43歲。對照組：健康體檢人員35例，平均年齡53.66±5.80歲。其中，DN組T2DM的診斷符合中國2型糖尿病防治指南(2017年版)[6]中T2DM的診斷標準；根據(jù)Mogensen分期，達到DNⅢ期、Ⅳ期標準。所有入組研究對象均知情同意并簽署知情同意書。由新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 方法

1.3.1 引物的設計與合成：根據(jù)Genbank中人IL-10，β-actin的基因序列信息，使用Primer 5.0軟件設計3對引物(分別簡稱P1，P2，P3)。由北京六合華大基因科技有限公司合成。IL-10的熒光定量PCR擴增引物信息見表1。

表1 IL-10的熒光定量PCR擴增引物

1.3.2 血液樣本處理：抽取外周靜脈血3 ml置于抗凝管中，4℃保存，24 h內進行處理。

分離淋巴細胞：3ml人外周血淋巴細胞分離液加3ml的全血離心，600 g 20 min。吸取環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一離心管中；加入同體積的生理鹽水清洗淋巴細胞，250 g離心10 min后棄上清；重復清洗2次；棄上清后得細胞，加入500 μl的RNAiso Plus裂解細胞。

1.3.3 RNA的提取及cDNA的合成：提取RNA：向上述勻漿裂解液中加入三氯甲烷(RNAiso Plus的1/5體積量)，混勻，室溫靜置5 min。4℃ 12 000 g離心15 min，吸取上清液至另一離心管中。向上清中加入0.5倍RNAiso Plus體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min。4℃ 12 000 g離心10 min，棄上清，加入與RNAiso Plus等量的75%(v/v)乙醇，上下顛倒洗滌離心管管壁；4℃ 7 500 g離心5 min后棄上清。室溫沉淀干燥5 min，沉淀干燥后，加入20 μl的RNase-free水溶解沉淀。經(jīng)超微量分光光度計測定其濃度，并取2 μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)進行基因組DNA的去除并進行反轉錄反應。

1.3.4 熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化：20 μl反應體系：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)10 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μl，cDNA模板1 μl(在原液的基礎上稀釋不同的倍數(shù)：100，101，102，103，104)，滅菌水7 μl。程序設置：預變性95℃ 30s，變性95℃ 5s，延伸60℃ 34s，共40個循環(huán)；熔解曲線階段95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。在反應體系基礎上，使用3對不同的引物(P1，P2，P3)進行PCR擴增。

1.3.5 特異性檢測：熒光定量PCR結果熔解曲線分析查看是否有特異型單峰，并進一步將熒光定量PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，驗證擴增產(chǎn)物的特異性。

2結果

2.1 標準曲線 P1的相關系數(shù)為0.976 7，斜率為-2.474 6；P2的相關系數(shù)為0.782 2，斜率為-1.902 3；P3的相關系數(shù)為0.999 6，斜率為-3.272 2。在P3擴增體系下可以得到最優(yōu)的標準曲線，使起始模板濃度與循環(huán)數(shù)有良好的線性關系。

2.2 擴增曲線、熔解曲線 P3的擴增曲線符合標準的“S”形熒光擴增曲線，曲線拐點清楚，基線平而無明顯上揚趨勢；熔解曲線呈單一的主峰，說明擴增產(chǎn)物特異，沒有非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)，見圖1。

A：cDNA模板在100，101，102，103稀釋倍數(shù)下，引物為P3時獲得的擴增曲線；B：引物為P3時獲得的熔解曲線。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳 應用P1，P3擴增的產(chǎn)物基本穩(wěn)定，在cDNA模板稀釋倍數(shù)為100時，條帶清晰、穩(wěn)定，分辨率高；電泳僅觀察到一個預測大小的單條帶，說明特異性擴增無明顯的副產(chǎn)物；當cDNA模板稀釋倍數(shù)為103，104時，在P1，P3未見擴增產(chǎn)物，見圖2。

M：分子量標準 DL2000；1～5：熒光定量cDNA模板稀釋倍數(shù)依次為：100，101，102，103，104；A，B，C分別為P1，P2，P3在不同cDNA模板稀釋倍數(shù)下擴增的電泳成像結果。

圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖像

2.4 DN組與對照組IL-10 RNA表達水平 將建立的實驗條件用于檢測兩組IL-10RNA的表達，結果顯示：與對照組(14.39±1.14)相比，DN組(16.21±1.84)的RNA表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.049，P<0.01)?？紤]到DNⅢ期、DNⅣ期的臨床表現(xiàn)不同，其IL-10RNA表達可能存在差異。因此，我們又進行了組間對比，結果顯示：DNⅣ期患者的RNA水平較DNⅢ期患者稍有升高，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.537，P=0.129)；但與對照組相比，DNⅢ期(16.69±1.06)與DNⅣ期(15.96±2.09)患者IL-10RNA的表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(t=8.452，5.248，均P<0.01)。

3討論以往研究表明，炎癥在DN的進展中起著重要作用[7]。IL-10作為目前公認的抗炎與免疫抑制因子，在DN的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要價值。關于在T2DM或DN中IL-10表達水平的檢測，目前的研究大部分都采用ELISA法，但得出了相矛盾的研究結果[2-5]。ELISA的檢測方法需要特異的抗體和一定量的蛋白，在進行抗原或抗體檢測時可能會出現(xiàn)假陽性或假陰性，靈敏度不高[8]；對分析低水平表達的細胞因子不夠敏感，且只能從單個樣本中分析有限的細胞因子。而實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)技術具有操作方法簡單、靈敏度高、特異度強的優(yōu)點，即使是對低水平的細胞因子基因表達，也是一種有效的定量方法。近年來，qPCR被廣泛用于定量細胞、體液、組織或組織活檢中RNA的表達水平。該技術不僅在分子生物學的各個領域得到了充分利用，在許多疾病的診斷方面，特別是腫瘤的早期診斷、療效觀察以及癌基因與腫瘤的關系方面也有涉及[9-10]。但qPCR 對反應條件的變化相當敏感，一旦條件不合適便得不到理想的結果，所以優(yōu)化反應條件是qPCR獲得可靠結果的前提[11]。

本研究利用qPCR來檢測IL-10RNA表達，從模板濃度、引物篩選兩方面進行探索，當20 μl反應體系475 ng RNA逆轉錄成cDNA后取1 μl，引物為F：5’-GTGATGCCCCAAGCTGAGA-3’，R：5’-CACGGCCTTGCTCTTGTTTT-3’時，能夠得到較為穩(wěn)定靈敏的擴增效果。我們前期通過ELISA法對比兩組IL-10表達水平，結果顯示DN組IL-10表達水平明顯低于對照組(P<0.01)。該結果與本實驗研究結果是一致的，進一步證實IL-10是參與DN發(fā)病機制的一個重要環(huán)節(jié)，其在DN患者中表達下調。

在關于IL-10在T2DM或DN中表達水平的研究中，本研究結果與YUAN等[4-5]一致，但與AL-SHUKAILI等[2-3]相反，考慮有以下原因：與以往研究不同，在關于DN患者的研究中我們首次參考了Mogensen分期，本研究中病例組主要以DNⅢ期、Ⅳ期為研究對象。WONG等[3]的研究未對入組標本進行分期；AL-SHUKAILI等[2]的研究中其研究對象為T2DM患者，尚未發(fā)展至DN階段。因此研究結果不一致可能與入組標準不一致、入組患者結構、年齡及病程存在差異有關。另外，本研究中DNⅢ期、Ⅳ期患者的IL-10RNA表達無統(tǒng)計學意義，考慮可能受樣本量小的影響。綜上，本研究優(yōu)化的實驗條件操作簡單、結果穩(wěn)定，利于臨床推廣應用；該檢測方法可為DN抗炎機制的研究提供技術支持。