董潤楠，宋志英，王文淵

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是指當腹壓增加，如大笑、咳嗽、打噴嚏、行走、搬重物等的時候，在膀胱逼尿肌未收縮的情況下，患者出現(xiàn)尿液漏出且不能自行控制，嚴重影響患者的正常生活、工作、社交和兩性關(guān)系，威脅婦女軀體、心理和社會等方面的健康?；谂璧渍w理論和吊床理論，SUI的發(fā)生與肛提肌的損傷密切相關(guān)。機械生長因子（mechano growth factor，MGF）是骨骼肌損傷后局部微環(huán)境中表達迅速上調(diào)的一種生長因子，發(fā)揮修復再生作用的具體機制不清。本研究通過檢測女性SUI患者及直腸癌根治術(shù)患者肛提肌成肌細胞的存活率及層黏連蛋白（Laminin）、肌營養(yǎng)不良蛋白（Dystrophin）的表達情況，初步探索MGF對SUI治療作用的具體機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑及儀器 MGF購自上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自上海吉爾生化有限公司，胎牛血清（FBS）購自上海舜冉生物科技有限公司，DMEM細胞培養(yǎng)基購自上海拜力生物科技有限公司，兔抗橫紋肌輔肌動蛋白抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG抗體、總RNA提取試劑盒、超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。倒置三目生物顯微鏡購自上海領(lǐng)成生物科技有限公司，CO2培養(yǎng)箱購自上海皓莊儀器有限公司，熒光顯微鏡、CFX Connect實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀購自上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司，離心機購自常州中捷實驗儀器制造有限公司，臺式空氣恒溫振蕩器購自太倉市華美生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗取材 選擇2016—2017年于山西省婦幼保健院婦產(chǎn)科診斷為SUI并行盆底修復手術(shù)的患者1例，術(shù)中鉗夾3～4塊5 mm×5 mm×5 mm肛提肌組織，液氮罐中保存。選擇同期于山西省腫瘤醫(yī)院診斷為低位直腸癌并行經(jīng)腹會陰聯(lián)合根治術(shù)的患者1例，同法取得肛提肌活檢標本。

1.2.2 肛提肌成肌細胞分離培養(yǎng) 將肛提肌活檢標本剪成1 mm3的碎塊，Hanks液沖洗3次。往碎塊中加入按1∶1混合的膠原酶（0.1%）和胰蛋白酶（0.25%），消化2次（37℃，30 min/次）。取第2次消化所得的細胞懸液，加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化。移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。取細胞沉淀，再加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶靜置（37℃，30 min）。取細胞懸液，計數(shù)，按1×104個/mL的密度接種至培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃，5%CO2，飽和濕度）。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況，當細胞融合度達到90%以上時再消化傳代。

1.2.3 肛提肌成肌細胞鑒定 磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗培養(yǎng)皿3次（3 min/次）。4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS浸洗培養(yǎng)皿 3次（3 min/次）。PBS配制的 Triton X-100（0.5%）室溫通透20 min。PBS浸洗培養(yǎng)皿3次（5 min/次），移液槍吸干PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加牛血清白蛋白溶液（5%）封閉30 min（37℃）。移液槍吸干封閉液，不洗。在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足夠量的稀釋好的一抗：兔抗橫紋肌輔肌動蛋白抗體（1∶250），4℃孵育過夜。PBS浸洗培養(yǎng)皿3次（3 min/次），移液槍吸干多余液體，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加稀釋好的熒光二抗：FITC標記的羊抗兔IgG抗體（1∶200），37℃孵育 30 min。PBS浸洗培養(yǎng)皿 3次（3 min/次）。在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加DAPI避光孵育5 min。對標本進行染核，PBS洗去多余的DAPI，20%甘油封閉培養(yǎng)皿。在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4 MTT法檢測肛提肌成肌細胞增殖活力 取SUI患者的第3代肛提肌成肌細胞，分為4組：SUI組（0 ng/mL）加1 μL生理鹽水，MGF組（50 ng/mL）加 1 μL濃度為 50 ng/mL的MGF，MGF組（100 ng/mL）加 1 μL濃度為 100 ng/mL 的 MGF，MGF組（150 ng/mL）加 1 μL濃度為 150 ng/mL的 MGF，每組設(shè)6個復孔。將細胞密度重懸為1×104個/mL（血細胞計數(shù)板計數(shù)），加至96孔板（每孔100 μL）繼續(xù)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞生長情況，當細胞鋪滿70%～80%時，更換無血清培養(yǎng)液，孵育 24 h。分別于干預后 24 h、48 h、72 h，每孔加 50 μL MTT試劑，4 h后吸出上清，加150 μL二甲基亞砜，振蕩器振蕩10 min，在550 nm波長處測定各孔吸光度（OD）值。計算公式：細胞存活率（%）=[OD（MGF組）-OD（空白）]/[OD（SUI組）-OD（空白）]×100%。

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法檢測肛提肌成肌細胞Laminin、Dystrophin mRNA的表達 于SUI患者的第3代肛提肌成肌細胞孵育72 h后，采用RT-PCR法測定SUI組（0 ng/mL）、MGF 組（150 ng/mL）Laminin、Dystrophin mRNA 的含量，取直腸癌根治術(shù)患者的第3代肛提肌成肌細胞作為對照組。根據(jù)說明書用總RNA提取試劑盒、超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將Laminin上游引物設(shè)計為5′-CTCTGGGGAACTGGAGAATC-3′，下游引物設(shè)計為 5′-ACTTGGGCGTGAACTTGTAG-3′。Dystrophin上游引物設(shè)計為 5′-TTTGGTGGGAAGAAGTAGAGG-3′，下游引物設(shè)計為 5′-GTTGACATTGTTCAGGGCAT-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物設(shè)計為5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′，下游引物設(shè)計為 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3′。這三者產(chǎn)物長度分別為72 bp、230 bp和 224 bp。PCR 反應(yīng)體系 25 μL：95℃ 10 min預變性；95℃10 s變性；57℃30 s退火；72℃30 s延伸，循環(huán)40次。實驗重復3次。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt比較法算出各組肛提肌成肌細胞中Laminin、Dystrophin mRNA的相對表達量。在P＜0.05 的情況下，如果 2-ΔΔCt＜1，說明目的基因在實驗組中表達下調(diào)；如果 2-ΔΔCt＞1，說明目的基因表達上調(diào)；否則表達無差異。

1.3 統(tǒng)計學方法 用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。定量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；MGF 濃度、MGF 作用時間、肛提肌成肌細胞存活率的數(shù)據(jù)資料采用析因設(shè)計的方差分析；肛提肌成肌細胞Laminin、Dystrophin mRNA表達的數(shù)據(jù)資料采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肛提肌成肌細胞電鏡觀察及鑒定 與對照組相比，SUI組（0 ng/mL）第3代肛提肌成肌細胞生長密度較小，細胞形態(tài)較皺縮，光澤度較弱。MGF組（50 ng/mL）、MGF 組（100 ng/mL）、MGF 組（150 ng/mL）的細胞生長密度漸增大，細胞形態(tài)漸飽滿，結(jié)構(gòu)漸完整，光澤度漸強。見圖1。對照組和SUI組（0 ng/mL）第3代肛提肌成肌細胞均表達骨骼肌細胞標志性蛋白——橫紋肌肌動蛋白。見圖2（見后插一）。

圖1 各組第3代肛提肌成肌細胞電鏡觀察

2.2 不同濃度、不同干預時間肛提肌成肌細胞存活率比較 不同濃度MGF促進肛提肌成肌細胞增殖的效果不同（F濃度=65.055，P濃度=0.000）；不同 MGF作用時間促進肛提肌成肌細胞增殖的效果不同（F時間=24.586，P時間=0.000）；MGF 濃度和 MGF 作用時間兩因素間存在交互作用（F時間×濃度=3.222，P時間×濃度=0.008），當MGF濃度為150 ng/mL和MGF作用時間為72 h時，肛提肌成肌細胞存活率最高。見表1。

2.3 各組肛提肌成肌細胞 Laminin、Dystrophin mRNA的表達量比較 與對照組比較，SUI組（0ng/mL）肛提肌成肌細胞Laminin、Dystrophin mRNA的表達量降低（P＜0.05）；與 SUI組（0 ng/mL）比較，MGF 組（150 ng/mL）肛提肌成肌細胞 Laminin、Dystrophin mRNA的表達量增加（P＜0.05）。見表2。

表1 不同濃度、不同干預時間肛提肌成肌細胞存活率比較（±s，%）

表1 不同濃度、不同干預時間肛提肌成肌細胞存活率比較（±s，%）

注：F 濃度=65.055，P 濃度=0.000；F 時間=24.586，P 時間=0.000；F 時間×濃度=3.222，P 時間×濃度=0.008。

MGF濃度 n 24 h 48 h 72 h SUI組（0 ng/mL） 6 100 100 100 MGF 組（50 ng/mL） 6 104.607±4.931 106.218±2.356 115.722±4.577 MGF 組（100 ng/mL） 6 108.316±4.282 110.669±3.184 115.946±4.791 MGF 組（150 ng/mL） 6 112.159±4.127 114.245±3.026 120.228±4.046

表2 各組肛提肌成肌細胞Laminin、Dystrophin mRNA的表達量比較（±s，2-ΔΔCt值）

表2 各組肛提肌成肌細胞Laminin、Dystrophin mRNA的表達量比較（±s，2-ΔΔCt值）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b 與 SUI組比較，P＜0.05。

組別 n Laminin mRNA Dystrophin mRNA對照組 3 1.028±0.029 0.964±0.137 SUI組（0 ng/mL） 3 0.404±0.050a 0.505±0.177a MGF 組（150 ng/mL） 3 0.871±0.110b 0.846±0.173b F 32.789 5.134 P 0.000 0.029

3 討論

中國成年女性SUI、急迫性尿失禁和混合性尿失禁相應(yīng)的比例分布分別為61%、8%和31%，患病率分別為18.9%、2.6%和9.4%，在50～59歲年齡段，SUI的患病率最高，為28.0%[1]。SUI患者不僅表現(xiàn)為腹壓增加下不自主溢尿，還可出現(xiàn)性交不適、尿路感染、外陰濕疹等，同時伴隨羞恥、尷尬、自卑、抑郁等情緒，導致患者減少外出工作、生活及社交，并減少性行為。Lim等[2]招募年齡≥21歲、處于性活躍期的女性310例（SUI患者134例，無SUI健康受試者176例）及其伴侶進入研究，女性完成Golombok Rust性滿意度量表（GRISS）和國際尿失禁咨詢委員會-下尿路癥狀-生活質(zhì)量問卷（ICIQ-Lutsqol），伴侶僅完成GRISS量表，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與無SUI健康受試者相比，SUI患者總體性功能、性交頻率、滿意度均較低（P＜0.001），生活質(zhì)量也較差；與無SUI健康受試者的伴侶相比，SUI患者的伴侶在勃起功能障礙方面存在更多問題。除此之外，SUI的經(jīng)濟成本也很高，大多數(shù)原因在于患者自付的可吸收墊、洗衣等尿失禁常規(guī)護理所需資源的費用。且每人每年在SUI上的花費差異很大，大約在50～1 000美元之間，SUI程度越嚴重，患者經(jīng)濟負擔越重[3]。

目前，非手術(shù)和手術(shù)方式均已用于女性SUI治療。非手術(shù)方式包括認知行為療法、注射療法、物理治療、西藥治療和中醫(yī)治療等[4-6]。手術(shù)方式包括經(jīng)陰道無張力尿道中段懸吊術(shù)（TVT）、經(jīng)閉孔（由外向內(nèi)）無張力尿道中段懸吊術(shù)（TOT）、經(jīng)閉孔（由內(nèi)向外）無張力尿道中段懸吊術(shù)（TVT-O）、單切口尿道中段吊帶術(shù)和Cooper韌帶懸吊術(shù)等[7-10]。手術(shù)方式治療女性SUI有其適應(yīng)證，且患者需承擔手術(shù)治療所帶來的創(chuàng)傷、風險、費用和并發(fā)癥等問題[11-12]。近年來，非手術(shù)方式治療女性輕、中度SUI得到了臨床工作者的廣泛研究，它們或微創(chuàng)，或無創(chuàng)，在風險、費用和并發(fā)癥等方面的問題較少，同時又能幫助患者改善SUI癥狀。

迄今為止，已有多種理論和學說用于解釋SUI的發(fā)病機制。在盆底整體理論和吊床理論這兩種理論中，均強調(diào)了尿控機制中肛提肌的重要作用[13]。與其他大多數(shù)骨骼肌不同，肛提肌除了排尿、排便和Valsalva動作外，能一直保持休整狀態(tài)，具有在腹壓突然增加的情況下快速收縮的能力，從而最大限度地減少尿失禁和盆腔器官脫垂的風險，矛盾的是，肛提肌必須在分娩期間延伸甚至超出其限度，以允許嬰兒通過，但其在分娩后收縮以恢復正常功能[14]。SUI與肛提肌的損傷密切相關(guān)，而肛提肌作為骨骼肌，是有絲分裂后的組織，一旦形成，細胞分裂就不會發(fā)生在肌纖維內(nèi)，在產(chǎn)后誘導的肌肉生長過程中，所需的增殖細胞（成肌細胞）來源于肛提肌干（衛(wèi)星）細胞池，代表肛提肌自我修復的生物學儲備[15]。

MGF是胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor-1，IGF-1）可變剪接的產(chǎn)物，IGF-1 mRNA 前體3′端的選擇性剪接編碼3種不同的IGF-1前體蛋白：IGF-1Ea、IGF-1Eb 和 IGF-1Ec（信號肽+IGF-1成熟肽+E結(jié)構(gòu)域），這3種蛋白質(zhì)都含有成熟的IGF-1肽，并在E結(jié)構(gòu)域的氨基端部分共享一個共同的16個氨基酸序列，由于E結(jié)構(gòu)域羧基端的氨基酸序列不同，導致IGF-1這3種剪接變體具有不同的作用[16-19]。機械信號作用于嚙齒類動物和人類體內(nèi)除了肝臟以外的其他組織，以自分泌或旁分泌的形式產(chǎn)生嚙齒類動物的IGF-1Eb和人類的IGF-1Ec，命名為MGF。大量研究報道，早在肌肉損傷后2～24 h，MGF表達就會上調(diào)，通過其高度帶正電荷的E結(jié)構(gòu)域，迅速激活肌衛(wèi)星細胞，促進有絲分裂從而促進成肌細胞增殖，發(fā)揮骨骼肌損傷后修復作用[20-22]。吳國梁等[23]以SD大鼠的腓腸肌為研究對象，通過動物實驗證實了MGF的促增殖作用。黃艷等[24]對產(chǎn)后SUI模型大鼠施以MGFE肽注射治療，發(fā)現(xiàn)治療后SD大鼠的最大膀胱容量和漏尿點壓力均提高，尿道括約肌和肛提肌組織的肌纖維再生也較治療前更豐富。王聰娜等[25]發(fā)現(xiàn)外源性MGF E肽可促進產(chǎn)后SUI模型大鼠內(nèi)源性MGF的表達。

Laminin是由α、β和γ亞基的特定組合組成的異源三聚體蛋白，其α2鏈在骨骼肌的細胞外基質(zhì)中高表達，Dystrophin-糖蛋白復合物由幾種跨膜和外周成分組成，在骨骼肌的肌纖維膜中高表達，Dystroglycan是Dystrophin-糖蛋白復合物的核心蛋白，外周膜蛋白α-Dystroglycan以高親和力結(jié)合Laminin α2鏈，同時與跨膜蛋白β-Dystroglycan相連，后者又與結(jié)合了細胞骨架肌動蛋白的Dystrophin相連，形成細胞外基質(zhì)與細胞內(nèi)骨架蛋白之間的機械連接[26-28]。機械刺激作用于骨骼肌，破壞細胞外基質(zhì)-細胞骨架連鎖，使肌纖維膜穩(wěn)定性喪失、Laminin依賴性信號傳導破壞、對肌肉收縮期間肋狀體（costameres）側(cè)向傳遞力耐受程度降低等，可能導致各種肌營養(yǎng)不良癥的發(fā)生[27-29]。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度MGF促進肛提肌成肌細胞增殖的效果不同（P＜0.05）；不同MGF作用時間促進肛提肌成肌細胞增殖的效果不同（P＜0.05）；MGF濃度和MGF作用時間兩因素間存在交互作用（P＜0.05），當 MGF濃度為 150 ng/mL、作用時間為72 h時肛提肌成肌細胞存活率最高。說明MGF濃度和MGF作用時間兩因素可交互作用，促進體外培養(yǎng)的SUI患者的肛提肌成肌細胞增殖，證實了MGF的促增殖作用，與上述結(jié)論一致。不同于本研究，孫婧瑜等[30]以SD大鼠的腓腸肌衛(wèi)星細胞為研究對象，證實了MGF的促增殖作用。吳國梁等[23]則對健康成年SD大鼠的腓腸肌進行被動拉伸訓練，發(fā)現(xiàn)不管拉伸方式是持續(xù)性還是重復性，拉伸訓練后SD大鼠腓腸肌MGF及其mRNA的表達水平均顯著上升，同時腓腸肌濕重明顯增加。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，SUI組（0 ng/mL）與對照組比較，肛提肌成肌細胞Laminin、Dystrophin的表達降低（P＜0.05）。與SUI組（0 ng/mL）比較，MGF組（150 ng/mL）肛提肌成肌細胞Laminin、Dystrophin的表達增加（P＜0.05）。提示MGF可促進SUI患者肛提肌成肌細胞Laminin、Dystrophin的表達。Dystrophin表達降低與SUI發(fā)生的關(guān)系在王莉娜等[31]的研究中亦得到證實。Ca??o-Benedini等[27]在右后肢固定（保持足背完全跖屈）10 d大鼠的比目魚肌中發(fā)現(xiàn)了Laminin和Dystrophin表達增加。MGF促進Laminin、Dystrophin表達的具體機制仍有待進一步研究。

綜上所述，MGF可通過促進肛提肌成肌細胞的增殖以及Laminin、Dystrophin的表達來修復SUI患者損傷的肛提肌。生長因子注射療法很有前景，未來的研究必須確定其使用的適應(yīng)證、有吸引力的生長因子、最佳的手術(shù)技術(shù)和方法、最佳的實施注射時間、生長因子的劑量以及開發(fā)臨床相關(guān)的動物模型，深入理解生長因子療法改善SUI的機制。