段志剛

（鄭州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南鄭州 450002）

隨著社會不斷進步，畜產品衛(wèi)生與安全備受關注。大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）是腸出血性大腸桿菌（簡稱EHEC）的主要血清型，雖是條件致病菌但致病力強，我國自1988年，已有江蘇等省市從腹瀉病患者分離到O157：H7。根據大眾網濟南2017年7月27日訊，濟南檢驗檢疫局首次在濟南空港口岸從臺灣入境中國籍旅客中檢出大腸桿菌O157感染病例。為了解本市市售生鮮豬肉中是否存在O157：H7，我們分別于2017年10～12月，2018年2～3月分兩組對鄭州市部分市售生鮮肉進行了大腸桿菌的分離鑒定，并采用雙重PCR法對分離株進行鑒定，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 待檢樣品

檢測生鮮豬肉樣品分別來自儉學街思達超市、儉學街雙匯連鎖店、信息學院路丹尼斯超市和金城冷鮮肉四個地點，分3個批次，共27份。

1.2 主要的儀器、培養(yǎng)基、試劑

儀器：OLYMPUS光學顯微鏡；Bio-rad PCR擴增儀等。

培養(yǎng)基：亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、伊紅美蘭瓊脂（EMB）、膽硫乳培養(yǎng)基（DHL）、普通肉湯、甘油等。

PCR反應試劑：2×PCR TaqMix；引物的設計與合成：設計大腸桿菌O157：H7的O157菌體抗原rfbE基因和H7鞭毛抗原fliC基因為靶基因對應的引物，由上海博尚生物技術有限公司合成[2，3]。

基因 引物 序列 擴增片段rfbE RfbE-F 5’-CTACAGGTGAAGGTGGAATGG-3’ 327bp RfbE-R 5’-TTCCTCTCTTTCCTCTGCGG-3’fliC FliC-F 5’-TACCATCGCAAAAGCAACTCC-3’ 247bp FliC-R 5’-GTCGGCAACGTTAGTGATACC-3’

1.3 程序和方法

1.3.1 樣品制備

取20g樣品剪碎與含有180ml的滅菌生理鹽水，充分研磨制成1：10樣品勻液。

1.3.2 選擇性增菌

將1：10樣品勻液取25ml接入SC增菌液，36℃培養(yǎng)18～24h。

1.3.3 分離純化

挑取增菌液，接種于EMB平板和DHL平板，36℃培養(yǎng)18～24h，挑取可疑菌落接種普通肉湯，再次劃線分離，直至得到純化的菌落為止。

1.3.4 鏡檢保存

1.3.5 三糖鐵（TSI）試驗、甲基紅試驗、動力-硝酸鹽試驗等生化項目檢驗。

1.3.6 雙重PCR法檢驗

（1）制備細菌模板DNA。

（2）PCR反應程序：94℃預變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃10min。

（3）凝膠電泳試驗。

2 結果

2.1 分離菌形態(tài)與染色特性

革蘭氏染色鏡檢，為革蘭氏陰性菌，紅色，菌體兩端鈍元，中等大小，呈桿狀，不產生莢膜，無芽孢，符合大腸桿菌形態(tài)染色特性。

2.2 分離菌培養(yǎng)特性

普通肉湯中培養(yǎng)18～24h，出現(xiàn)均勻渾濁，底部粘性沉淀物，伴有臭味，表面形成一層菌膜，符合大腸桿菌在普通肉湯中培養(yǎng)特性。伊紅美藍平板上培養(yǎng)24h，出現(xiàn)紫黑色菌落，有時帶綠色金屬光澤，光滑，突起。在DHL板上培養(yǎng)24h，出現(xiàn)粉紅菌落，光滑，突起。符合大腸桿菌在EMN和DHL平板上的培養(yǎng)特性。

2.3 生化試驗結果

初步判定有74株是大腸桿菌典型陽性菌株，不能判斷是否有大腸桿菌0157：H7。

2.4 大腸埃希菌O157：H7的檢測結果

74株大腸桿菌，PCR擴增結果顯示，有1株與大腸桿菌O157：H7標準菌株的目的片段（247bp和327bp）一致，為陽性菌株。其余73個菌株均為陰性。如圖1所示。

3 分析與討論

本次試驗在74份生鮮豬肉樣品中檢出1株大腸桿菌0157：H7，說明本市生鮮豬肉品中存在威脅民眾身體健康的食源性病原菌，需重視其質量安全。

要想控制大腸桿菌O157：H7對食品的污染，首先，從生豬養(yǎng)殖到屠宰嚴格按照動物防疫法做好消毒防疫檢疫。其次，建立實用高效的檢測手段。實時熒光定量PCR是目前較為先進的技術，特異性好、靈敏度高，讀取結果精確直觀，已成為食源性致病菌檢測的重要方法。本試驗雖然采用普通PCR檢測，但依然有相當高的可信度。再次，加強立法工作，完善相關法律法規(guī)，增強從業(yè)人員的主體責任和衛(wèi)生意識，同時加強市場檢測力度。