曹瑞敏 米克熱木·沙衣布扎提 陳保君 張守泉 蔣志惠* 張小鶯，*

（1.動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊 830052；2.河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，安陽工學(xué)院，河南安陽 455000；3.湯陰醫(yī)藥開發(fā)辦公室，河南安陽 456150）

艾屬菊科（Asteraceae）蒿屬（Artemisia），是多年生草本或略成半灌木狀宿根草本植物，植株有濃烈香氣，廣泛分布于亞高山地區(qū)草原[1]。北艾產(chǎn)自河南省安陽市湯陰縣，是中國“四大名艾之首”。湯陰北艾之九頭仙艾因扁鵲而得名，戰(zhàn)國時(shí)期扁鵲在魏國湯陰邑一帶行醫(yī)，常用九頭仙艾治病，北艾精油是北艾主要成分[2]。北艾以葉入藥，主要活性成分有1，8-桉葉素、倍半萜烯醇及其酯等[3]，其中1，8桉油精具有抗氧化的作用[4]。該類植物的提取物具有抗腫瘤、抗炎、抗血小板凝聚、抑制NO生成、鈣拮抗等活性作用[5]。因艾草藥用功能顯著且價(jià)格低廉，其在藥用和保健上的關(guān)注度逐年上升。

對乙酰氨基酚（N-acetyl-para-aminophenol，APAP），是一種廣泛使用的解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床上常用于治療感冒引起的發(fā)熱和緩解輕疼痛[6]。APAP能迅速被腸道吸收并在肝臟內(nèi)代謝，APAP安全劑量下療效確切，用藥可靠，大多數(shù)（85%-90%）由UDP-葡萄醛酸基轉(zhuǎn)移酶和磺基轉(zhuǎn)移酶催化，有10%的APAP通過細(xì)胞色素P-450酶代謝，特別是CYP2E1亞型酶代謝產(chǎn)生具有毒性的中間體N-乙酰基對苯醌亞胺（NAPQI）[7，8]。NF-κB是炎癥的主要調(diào)節(jié)因子，NF-κB的激活與炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈相關(guān)[9]。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是一種促炎細(xì)胞因子，在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。大多數(shù)TNF-α基因多態(tài)性位于啟動子地區(qū)，并且它們被認(rèn)為是影響人類不同疾病的易感性和嚴(yán)重程度[10]。APAP誘導(dǎo)的肝功能異常除了與肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等有著緊密關(guān)系[11]。

北艾精油和1，8桉油精具有抗氧化、抑制炎癥的作用，推測其具有潛在治療藥物性肝損傷的作用。為證明這一假設(shè)，我們利用APAP誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型，研究艾草精油及其主要成分1，8桉油精對肝臟損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為北艾后續(xù)的研究提供數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)昆明小鼠購于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)為20～25g。

1.2 主要試劑

北艾采自河南省安陽市湯陰縣扁鵲廟，采摘時(shí)間為2018年5月；總mRNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒、SYBR@Green Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（5977A-MSD）購自美國安捷倫科技有限公司、實(shí)時(shí)熒光定量PCR （2720）購自Life Technologies有限公司、超高速離心機(jī)（5810R）購自上海艾研生物科技有限公司、光學(xué)顯微鏡（BX53）購自日本Olympus精密儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 北艾提取物的制備與鑒定

2.1.1 北艾精油的提取

艾葉經(jīng)過自然晾干后粉碎，稱取60 g艾絨溶于0.6 L蒸餾水中，95℃加熱2 h，分離下層艾露，收集上層精油，重復(fù)3次。

2.1.2 北艾精油成分的鑒定

氣相色譜條件為：H P-5 m s非極性毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），載氣為氦氣，流量10 mL/min，進(jìn)樣量2μl，初始溫度70℃，采用程序升溫以10℃/min速率升溫至95℃，以5℃/min速率升溫到125℃，以6℃/min速率升溫到180°C，以20℃/min速率升溫到280℃，分流比15∶1。

質(zhì)譜分析條件為：離子源為EI，電離電壓70eV，進(jìn)樣口溫度200℃，離子源溫度230℃，掃描范圍30～600amu。

取上述揮發(fā)油10μL置進(jìn)樣瓶中，用甘油定容至10ml。按照“1.2.2色譜質(zhì)譜條件”對艾草揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，將分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)與Demo、Nilt08譜庫進(jìn)行成分比對。

2.2 給藥處理及分組

昆明小鼠，體重18～25g，動物飼養(yǎng)于恒溫環(huán)境，自由進(jìn)食。按隨機(jī)分組原則將30只小鼠隨機(jī)分為6組，每組5只，藥物組提前0.5h給于APAP。分別為正常對照組（NC），APAP模型組（300mg/kg），N-乙酰-L-半胱氨酸陽性對照組（100mg/kg，NAC），APAP+北艾精油（100mg/kg，0.1%吐溫80，APAP+EOs）組，APAP+1，8桉油精（28mg/kg，0.1%吐溫80，APAP+1，8）組以及1，8桉油精對照組（28mg/kg，0.1%吐溫80，1，8）。NAC組及各實(shí)驗(yàn)組按300mg/kg體重腹腔注射APAP，NC組腹腔注射相同體積的生理鹽水。每組連續(xù)給藥3d，給藥間隔為8h。最后一次注射藥物24h后，脫頸致死摘除小鼠肝臟，用0.9%生理鹽水洗滌表面的血污，剪取肝臟部分右葉固定于4%甲醛固定液中，待24h后進(jìn)行組織病理切片制備及形態(tài)學(xué)分析。剩余肝臟分裝，-80℃保存，備用。

2.3 組織切片的制作與觀察

剪取由4%甲醛固定液中的肝組織進(jìn)行脫水透明、石蠟包埋，靜置6～h，切片（5nm）后貼片放入37℃烘箱過夜，脫蠟，最后用蘇木精和伊紅（H&E）染色，封片鏡檢。

2.4 相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)

根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行樣品提取，在260nm和280nm吸光度下檢測RNA吸光度，符合兩者比值1.8～2.0之間，使其濃度調(diào)節(jié)至1mg/L，取mRNA1μg進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，將cDNA分裝存放-80℃保存，備用。取cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，使用特異性引物直接擴(kuò)增特異性cDNA（表1）。實(shí)時(shí)熒光定量q-PCR在QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System上使用SYBR?GreenMaster Mix檢測。以β-actin作為內(nèi)參，帶入公式2-（ΔΔCt）將mRNA的目的基因與對照基因?yàn)橄鄬Ρ磉_(dá)的比率。

表1 cDNA片段實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增引物Fig.1 The q-PCR primer of cDNA fragment

3 結(jié)果

3.1 北艾精油成分

采用GC-MS法分析北艾精油成分。各成分的質(zhì)子總離子圖如圖1所示。從北艾精油中鑒定出各色譜峰的化學(xué)成分，除溶劑以外的全部峰面積作為100%，同時(shí)采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算出各成分的相對百分含量（表2）。結(jié)果顯示，從北艾中共檢測出15種化學(xué)成分，主要包括黃酮類、半萜類等，主要成分有1，8桉油精、龍腦、α-水芹烯和萜品油烯等，各占5.9%、11.4%、24.9%、11.0%和14.6%。

3.2 北艾精油和1，8桉油精緩解肝組織病變

1，8桉油精和正常對照組的肝細(xì)胞以中央靜脈為軸心呈放射狀，排列整齊，出現(xiàn)多細(xì)胞核（圖2A，F(xiàn)）；APAP處理后引起嚴(yán)重肝細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為肝細(xì)胞大量壞死、中心性腦泡變性和淋巴細(xì)胞浸潤（圖2B）。在APAP-EOs組中，小葉區(qū)肝細(xì)胞的一小部分表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)空泡，較APAP組壞死細(xì)胞明顯減少，肝損傷明顯減輕（圖2D），1，8桉油精與NAC組（圖2C，D）相似，與APAP組肝損傷相比有明顯的區(qū)別。表明北艾精油和1，8桉油精能夠緩解APAP引起的肝毒性病理變化，對肝損傷有明顯的治療作用。

圖1 北艾水提取的總離子流色譜圖

圖2 北艾精油和1，8桉油精對APAP誘導(dǎo)的肝臟組織病理學(xué)變化

3.3 北艾精油和1，8桉油精抑制炎癥相關(guān)因子的表達(dá)

與正常對照組比較，APAP處理后小鼠肝臟TNF-α、IFN-γ、CXCL-1、STAT-3、TLR-4、VCAM-1和NF-κB水平顯著升高（p ＜ 0.05，圖3）。經(jīng)北艾精油及其主要成分1，8桉油精分別治療后，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)水平均較APAP模型組下降。其中TNF-α、IFN-γ和TLR-4顯著下降，分別為1.59，1.78；1.95，1.68；2.55和1.92倍。

圖3 北艾精油和1，8桉油精對炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

4 討論

在菊科蒿屬植物中，北艾具有非常重要的藥用價(jià)值并且作為藥物有著很長的歷史[12]。本研究通過水蒸餾法提取出來的北艾精油得率為0.3%，采用GC-MS分析，鑒定出主要活性成分中1，8桉油精在北艾精油中相對百分含量為5.9%。

藥物性肝損傷是引起急性肝功能衰竭的主要原因，其中APAP是最常見的誘導(dǎo)劑[13]。APAP過量（300mg/mL）可引起小鼠嚴(yán)重的肝毒性，APAP中毒時(shí)，II期偶聯(lián)酶飽和，較高的部分轉(zhuǎn)化為NAPQI，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和肝細(xì)胞壞死[14]。HE染色結(jié)果表明，APAP小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的病理改變，如排列疏松、空泡變性、壞死明顯（圖2B），同時(shí)炎癥因子以及趨化因子TNF-α、IFN-γ、STAT-3CXCL-1、TLR-4、VCAM-1和NF-κB表達(dá)顯著增加，表明APAP肝損傷模型構(gòu)建成功。

表2 北艾精油主要成分的GC-MS分析結(jié)果

在給予北艾精油和1，8桉油精治療后，肝臟細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，細(xì)胞壞死現(xiàn)象明顯得到緩解（圖2）。Toll樣受體（Tolllike receptors，TLR）是作為連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR4能識別外源性的病原體或識別內(nèi)源性物質(zhì)及產(chǎn)物，可激發(fā)NF-κB等一系列信號通路，并且上調(diào)促炎因子、趨化因子的釋放[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明APAP過量的情況下NF-κB的表達(dá)顯著增加，組織中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、STAT-3以及趨化因子CXCL-1和VCAM-1的表達(dá)也增加。經(jīng)北艾精油及其1，8桉油精治療后，其可下調(diào)TNF-α、TLR-4等基因的表達(dá)。說明北艾精油及其1，8桉油精可以抑制炎癥因子的分泌，減少APAP引起的肝臟損傷，提示北艾精油及其1，8桉油精可能通過抑制炎癥因子的表達(dá)進(jìn)而緩解肝臟損傷。

5 結(jié)論

北艾精油及從其鑒定出的主要成分1，8桉油精具有顯著的緩解肝損傷和抗炎作用，能有效治療過量APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死和肝毒性。