毛瑞鋒 林思雨 宋慶浪 蔣珊珊 孫宇喆 原冬偉

(黑龍江省八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院,黑龍江大慶 163319)

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis of swine，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）引起的一種高度接觸性傳染病，可以感染任何年齡段的豬，對15日齡左右的仔豬危害最大，死亡率可達(dá)100%。1946年美國學(xué)者首次報道TGE，我國于1964年首次分離得到TGEV，到目前為止，我國大部分地區(qū)都存在該病毒。本病目前已呈世界性分布，目前是造成仔豬發(fā)病和死亡的主要疫病之一，給養(yǎng)殖業(yè)造成極大損失。目前對TGEV的檢測方法主要有病毒的分離鑒定、電子顯微鏡檢測、血清學(xué)檢測（病毒中和試驗、ELISA、膠體金）、間接免疫熒光、免疫組化、核酸探針雜交技術(shù)檢測、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、熒光定量PCR等。這些檢測方法都具有良好的特異性和靈敏性，可以對臨床樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的實驗室檢測，但是都存在缺點和不足，特別是一些檢測方法對操做人員或儀器有較高要求，不利于推廣，所以很難用于基層臨床檢測。因此建立一種簡單、快速的檢測方法開始成為目前此方面的研究重點。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）是在2000年日本學(xué)者 Notomi 等開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點是針對靶基因的 6 個區(qū)域設(shè)計 4 種特異引物，核酸鏈通過在等溫環(huán)境中的循環(huán)置換擴(kuò)增實現(xiàn)對靶序列的放大。該方法能在恒溫條件下快速、準(zhǔn)確、特異地擴(kuò)增目的DNA的技術(shù)，在反應(yīng)體系加入逆轉(zhuǎn)錄酶后，也可直接檢測RNA。由于這種檢測方法的具有具有簡單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方便、結(jié)果判定簡單、成本低廉等特點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用，有著極為廣泛的應(yīng)用前景。目前該技術(shù)已被利用于多個領(lǐng)域?qū)Σ煌≡w進(jìn)行檢測，如在錦鯉皰疹病毒，非洲豬瘟病毒，H7N9禽流感病毒、犬細(xì)小病毒等動物病毒性病原的檢測上得到了應(yīng)用。本研究針對 TGEV N 基因保守區(qū)設(shè)計特異性引物，并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種適合基層實驗室使用的快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確的 RT-LAMP 檢測方法并進(jìn)行了初步臨床驗證。

1 材料與方法

1.1 病毒株、病料及主要試劑

TGEV-Q2016 和 TGEV-HX 株由本實驗室分離并保存；TGEV-HX由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈；PEDV、PDCoV、PRoV 均為本實驗室保存；臨床 TGEV 病料由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬病研究室提供；DNA/RNA 提取試劑盒、隨機(jī)引物、反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA 酶抑制劑（RNase Inhibitor）、dNTPs 購自索萊寶生物有限公司；DNA 聚合酶（Bst DNA Polymerase）購自 NEB公司；甜菜堿（Betaine）購自 Sigma 公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

參照 GenBank 中 36 株 TGEV 分離株 N 基因序列，DNAStar中 MegAlign 分析程序?qū)Ρ冗x取同源性95%以上的保守區(qū)段序列，再利用在線軟件 Primer Explorer V5（http：//primerexplorer.jp/lamp5.0./index.html）作為輔助，在 TGEV N 基因保守區(qū)域篩選 4條最佳條件 RT-LAMP 引物，其中包括 2 條外引物 F3/B3 和 2 條內(nèi)引物 FIP/BIP（見表 1），擴(kuò)增目的片段大約 200 bp，引物由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。將引物用無菌蒸餾水溶解至 100 μmol/L，- 20℃ 保存?zhèn)溆?，使用時進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

表1 本試驗中使用的引物序列

1.3 病毒 RNA 提取和 cDNA 合成

用 TRIzol 試劑（Invitrogen 公司）提取病毒 RNA，具體操作方法參照說明書進(jìn)行。提取的病毒 RNA 用 20 μL DEPC 水溶解，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。往 20 μL 反轉(zhuǎn)錄體系中加入 RNA 溶解液、5×Buffer、dNTPs、RNase Inhibitor、M-MLV 和 9-mer 隨機(jī)引物，在42 ℃下水浴1 h，最后70 ℃ 10 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶。所得產(chǎn)物作為 LAMP 反應(yīng)的模板 DNA。

1.4 LAMP 檢測方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

以 TGEV-Q2016 株全長 cDNA 為模板，LAMP 擴(kuò)增體系初步按文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，根據(jù)反應(yīng)體系條件優(yōu)化策略，對內(nèi)外引物、Betaine 濃度、Bst DNA PoLymerase 濃度、dNTP 濃度、反應(yīng)溫度與時間等條件分別進(jìn)行了優(yōu)化。由于外引物對實驗結(jié)果影響很小，所以實驗中固定外引物濃度，調(diào)整內(nèi)引物濃度，使外引物與內(nèi)引物濃度比例分別為 1：1～1：7；Betaine（5 M/L）的終濃度為 0.1M～0.8M；Bst DNA PoLymerase（8000 U/mL）終濃度為2U～16U；dNTPs（10 mmol/L）的終濃度為 5 μM ～25 μM；在完成以上所有條件優(yōu)化基礎(chǔ)將溫度從 58 ℃～65 ℃，以 1℃ 依次遞增確定最佳退火溫度；反應(yīng)時間從 20 min～80min，以 10 min依次遞增確定最佳反應(yīng)時間。反應(yīng)結(jié)束后，取 6 μL RT-LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物，于 21% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。

1.5 LAMP 的敏感性試驗

將 TGEV-Q2016 株反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 作為模板，分光光度計確定濃度后計算起始拷貝數(shù)，無菌去離子水10 倍連續(xù)稀釋，運用優(yōu)化好的 LAMP 方法同時與實驗室常規(guī)檢測 TGEV 所用 PCR 進(jìn)行檢測，進(jìn)而對反應(yīng)的敏感性進(jìn)行比較。

1.6 LAMP 的特異性試驗

用建立好的 LAMP 方法分別對 TGEV-Q2016 株、TGEVHX、PEDV、PDCoV、PRoV進(jìn)行核酸擴(kuò)增，待反應(yīng)結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。

1.7 重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測

取等量的 5 份不同代次的 TGEV-Q2016 株細(xì)胞傳代回收樣品，對每份樣品提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄制備 cDNA 進(jìn)行 LAMP 檢測；同時對第 5 次傳代TGEV-Q2016 株樣品反復(fù) 5 次進(jìn)行 RT-LAMP檢測，檢驗所建方法的重復(fù)和穩(wěn)定性。

1.8 臨床樣品及符合性試驗

對臨床采集25份仔豬腹瀉病料提取核酸，同時進(jìn)行 RT-LAMP和 RT-PCR 檢測，并對實驗結(jié)果進(jìn)行陽性檢出率和符合率計算。

2 結(jié)果

2.1 LAMP 反應(yīng)體系的建立和條件的優(yōu)化

LAMP反應(yīng)結(jié)束擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明加入TGEV cDNA 樣品反應(yīng)液有特異性的梯狀條帶，陰性對照則無條帶出現(xiàn)（圖 1），擴(kuò)增序列與預(yù)期結(jié)果 200 bp 一致。

圖1 豬傳染性胃腸炎病毒RT-LAMP檢測結(jié)果，M：DNA Marker；1：RT-LAMP 產(chǎn)物；2：陰性對照

通過對 RT-LAMP 反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系為25 μl：10 μmol/L 外引物 F3 和 B3 各1 μl，10 μmol/L 內(nèi)引物 FIP和 BIP 各 1.5 μl，10 mmol/L dNTPs 為 0.7 μl，5 M/L Betaine 為0.8 μl，10×Thermo Buffer 為 2.5 μl，Bst DNA（8000U/ml）聚合酶為 6 u，模板2μl，用去離子水補(bǔ)足25 μl。反應(yīng)條件為：61 ℃45min；80℃ 2 min，優(yōu)化結(jié)果如（圖 2）所示。

2.2 LAMP 的敏感性

將含 2.65×106起始拷貝數(shù) TGEV cDNA 樣品進(jìn)行 10 被梯度稀釋，運用優(yōu)化的 LAMP 方法和 PCR 方法同時進(jìn)行檢測，LAMP方法檢測為陽性的最低起始拷貝數(shù)為 26.5 個拷貝（圖3），而PCR 方法檢測為陽性的最低拷貝數(shù)為 2650 個拷貝，說明 LAMP靈敏性比 PCR 要高出 100 倍。

2.3 RT- LAMP 的特異性

以 TGEV-Q2016 cDNA 樣品為陽性對照，分別擴(kuò)增 TGEVHX、PEDV、PDCoV、PRoV 提取制備的核酸樣品，結(jié)果表明只有TGEV-Q2016 株和 TGEV-HX 株擴(kuò)增出特異性的梯度條帶，其他病毒樣品與陰性對照相同無特異性條帶出現(xiàn)（圖 4）。

圖2 LAMP 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

圖3 LAMP反應(yīng)敏感性檢測結(jié)果

圖4 LAMP 特異性試驗檢測結(jié)果

2.4 LAMP 重復(fù)性和穩(wěn)定性

取不同代次以及同一代次的TGEV-Q2016 株細(xì)胞傳代回收樣品，提取病毒 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備 cDNA，然后進(jìn)行LAMP檢測，結(jié)果顯示同一反應(yīng)下不同代次 TGEV 樣品無明顯差異；相同代次樣品反復(fù)檢測結(jié)果同樣無明顯差異（圖 5）。

圖5 LAMP重復(fù)性與穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

將本實驗室 2016 年收集 25 份仔豬腹瀉糞便提取 RNA，同時進(jìn)行 RT-LAMP 和 RT-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如表 2 顯示 25 份樣品中RT-LAMP 共檢測出 8 份陽性，而 RT-PCR 只檢測出 5 份陽性，并且 RT-PCR 陽性檢出樣品的 RT-LAMP 檢測結(jié)果也是陽性，其符合率為 100 %，而且 RT-LAMP的檢出率明顯高于 RT-PCR 與敏感性實驗結(jié)果相符。

表2 RT-LAMP 和 RT-PCR 方法樣品檢測結(jié)果比較

3 討論

LAMP 方法作為一種新型快速高效的檢測方法，LAMP 技術(shù)是在傳統(tǒng)的 PCR 基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種理想的手段，其利用 BstDNA聚合酶和根據(jù)不同靶序列設(shè)計的兩對特殊的內(nèi)、外引物，特異性識別靶序列上的六個獨立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)。其特點是只需要一個恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)、檢測時間短、操作簡便、靈敏性高、特異性強(qiáng)等特點，因而該方法用于病毒、細(xì)菌、真菌的快速靈敏特異檢測和其他方面的檢測已經(jīng)成為熱點，具有更寬闊的應(yīng)用前景。

TGEV 可引起 2 周齡以內(nèi)仔豬發(fā)生以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和高度致死率為特征的急性、高度接觸性傳染病。該病自首次報道以來，目前呈世界性分布，季節(jié)性暴發(fā)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究建立了一種反應(yīng)時間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、判定容易、操作簡便、成本低廉可應(yīng)用于 TGEV 快速檢測的新方法，與常規(guī)核酸檢測方法相比具有明顯的優(yōu)點，首先該方法成本低廉、方法簡單，僅利用 Bst DNA polymerase 在 61 ℃ 恒溫于水浴鍋中就可完成反應(yīng)，無需高精度儀器的輔助；其次是反應(yīng)時間短，整個試驗只需要 2 h 左右，與常規(guī) PCR 反應(yīng)相比至少減少 2.5 h 以上，大大縮短了檢測時間；其次其特異性好，對其它病原呈陰性反應(yīng)；最后其靈敏度高，是常規(guī) PCR 靈敏度的 100倍。該方法同時具有比傳統(tǒng) PCR 更高的靈敏性，比熒光定量 RTPCR 更方便的特性，完全能夠滿足基層檢驗工作的需要。該檢測方法的建立將降低獸醫(yī)基層檢測單位的檢測難度、檢測時間，擺脫檢測人員素質(zhì)要求和檢測儀器要求的束縛，為該病的防制提供檢測理論基礎(chǔ)，有望發(fā)展為臨床檢測的有效手段而被推廣。