石凱文 張曉菊

(1.安陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南安陽(yáng) 455000;

2.安陽(yáng)市生態(tài)環(huán)境局殷都分局,河南安陽(yáng) 455000)

1 冷凍前精液預(yù)處理

通常，水浴平衡法是精子進(jìn)行冷凍前的慣用的保護(hù)精子的方法，首先讓精子有一定的時(shí)間用來(lái)適應(yīng)較低的溫度，不讓精子出現(xiàn)大量的損傷；在這個(gè)過(guò)程中，精子自身可以改變細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，同時(shí)可以讓防凍劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這兩種方式均可以使得精子在低溫的環(huán)境里有所適應(yīng)。

降溫和平衡是兩個(gè)不同的環(huán)節(jié)，但又存在著緊密的聯(lián)系。嚴(yán)格意義上講，不同的降溫時(shí)期，它的降溫速度是不可能相同的，12℃是分界點(diǎn)，之前的溫度下降十分緩慢，高于此溫度下降迅速。

為了使精液的溫度迅速下降到平衡時(shí)的溫度，我們需要在不同時(shí)期調(diào)節(jié)冷凍的方法，使之達(dá)到加快降溫的目的。

當(dāng)降溫結(jié)束后，精液稀釋液要進(jìn)入平衡階段，過(guò)快和過(guò)慢的降溫都不利于平衡階段的開(kāi)始，對(duì)精子的保護(hù)作用達(dá)不到預(yù)期的效果。

2 稀釋液的配制

在對(duì)凍精研究時(shí)，稀釋液是不可忽視的研究方面。生產(chǎn)稀釋液的快速化，商品化，可以大力的推廣人工受精和提高母畜的產(chǎn)仔率。

給精子提供必要的能量，預(yù)防過(guò)低溫度對(duì)它的損害，創(chuàng)造合適的生存環(huán)境等方面稀釋液有著不可替代的作用，它不但讓精液的容積得到了大幅增加，同時(shí)增加了母畜生產(chǎn)更多幼畜的概率，還能使得一些危害精子的病菌難以生存。

很多年來(lái)一直在使用所熟知的稀釋液的配方，沒(méi)有研發(fā)新的組分和試劑配伍，使得我國(guó)在這一方面落后于很多開(kāi)發(fā)新配方的國(guó)家，稀釋液的成分的組成是影響精子冷凍效果的最直接因素之一，相比于其他因素，改變其組分和比例更能快速地提高精子冷凍，以及精子解除冷凍后的活力。正因?yàn)橛泻芏辔覀兪熘囊蛩乜梢杂绊懙较♂屢旱馁|(zhì)量和效果，所以我們發(fā)展稀釋液的潛力非常巨大。

精液在保存的過(guò)程中，稀釋液種類的不同，所產(chǎn)生的保護(hù)效果也不盡相同，隨著時(shí)代的發(fā)展稀釋液的組分的成分比例也在不停的改善，稀釋液從原來(lái)的結(jié)構(gòu)成分單一到生產(chǎn)復(fù)雜，組分繁多，再變成簡(jiǎn)單、便捷。

例如，在牛、狗的精子冷凍保存里使用基于Tris-Citric acid類的稀釋液較普遍；在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和羊的凍精中，經(jīng)常采用Tris-Tes類的稀釋液；雖然已有文獻(xiàn)記載了一些稀釋液的配伍和組分比例以及它們?cè)趯?shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用，但是，經(jīng)驗(yàn)性和實(shí)驗(yàn)性仍然是哺乳動(dòng)物精子冷凍保存的主流。

除了表1中所例舉的稀釋液種類外，還有很多稀釋液在對(duì)哺乳動(dòng)物精液的保存中得到了廣泛的使用，它是決定凍精解凍后活力和母畜受孕率的重要的因素之一。

3 防凍劑

防凍劑的選擇是關(guān)系到冷凍精子解凍后活力的重要步驟，二十一世紀(jì)后，已有很多滲透性防凍劑進(jìn)入了生產(chǎn)環(huán)節(jié)，例如，甘油和胺類。

具有滲透功能的防凍劑在保護(hù)精子低溫耐受方面表現(xiàn)的極為出色，甘油除此功能外還有稀釋稀釋液的能力，更好的降低了冷凍液中鹽的解析，有學(xué)者指出，當(dāng)甘油濃度達(dá)到6%～8%時(shí)，冷凍效果最為明顯，解凍后精子的活力也最強(qiáng)。當(dāng)甘油濃度繼續(xù)上升時(shí)，冷凍精子復(fù)蘇后的活力會(huì)越來(lái)越低，這是由于甘油的毒性所致。

為了降低甘油的毒性，人們首先發(fā)現(xiàn)這種毒害作用不是一成不變的，當(dāng)在30℃時(shí)，精子的活力將很快的喪失；當(dāng)在20℃時(shí)，要通過(guò)數(shù)小時(shí)后，甘油的毒性才能表現(xiàn)出來(lái)；當(dāng)10℃時(shí)，精子的活力才會(huì)有輕微的下降。

研究者證明添加甘油的稀釋液使母畜有良好的受胎率應(yīng)該在5℃時(shí)進(jìn)行，與此同時(shí)，為了盡可能減小甘油的毒作用，可以先將精液稀釋一次，添加甘油再稀釋一次這樣的方法來(lái)降低甘油的危害精子的能力。

有研究說(shuō)明甘油的最適濃度由稀釋液的滲透壓來(lái)決定，同時(shí)與卵黃的含量呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)，降溫速度100℃/min時(shí)，效果最優(yōu)。

我們常見(jiàn)的防凍劑可以分為兩大類，如表2所示：介于防凍劑去除后，稀釋液中滲透壓的會(huì)產(chǎn)生很大的變化，這樣對(duì)細(xì)胞容易造成傷害?？梢钥紤]采用多個(gè)步驟去除精液中的防凍劑，這樣有利精子適應(yīng)新的環(huán)境，提高它解凍后的復(fù)蘇率和母畜的受胎。

表2 防凍劑的種類