仲光啟 由玉巖 徐艷春，3，4 劉學(xué)鋒 賈 婷金繼英 郭愛(ài)霞 張麗霞 楊淑慧*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.北京動(dòng)物園圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100044；3.國(guó)家林業(yè)與草原局野生動(dòng)物保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱，150040；4.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心，哈爾濱，150040；5.保定市動(dòng)物園管理處，保定，071000；6.濟(jì)南動(dòng)物園管理處，濟(jì)南，250031；7.太原動(dòng)物園，太原，030009)

黑鸛(Ciconianigra)屬鸛形目(Ciconiiformes)鸛科(Ciconiidae)鸛屬，無(wú)亞種分化，是一種體態(tài)優(yōu)美、分布廣泛、性情機(jī)警的大型涉禽，亞歐非均有其分布記載[1-4]。但黑鸛對(duì)棲息地環(huán)境，特別是覓食生境的要求極為苛刻，且食性較為單一[1，5]。因受氣候變化、棲息地破壞、人類活動(dòng)等影響，黑鸛的種群數(shù)量急速下降。據(jù)2006年羅祖奎等的研究，全國(guó)野外的種群數(shù)量在1 000只左右[6]。目前黑鸛已被列入《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書·鳥類》和《華盛頓公約·附錄II》[2]，因此，黑鸛的保護(hù)十分迫切。

國(guó)內(nèi)外圍繞黑鸛的研究已經(jīng)積累了一些資料，主要圍繞繁殖生態(tài)[7-11]、人工飼養(yǎng)技術(shù)[12-15]、性別鑒定[16-20]、疾病救護(hù)[21]、食性[5，22-23]、遷徙[24-27]、行為及越冬[28-31]等，為黑鸛的保護(hù)提供了基本依據(jù)。人工飼養(yǎng)繁育是瀕危物種保護(hù)的重要手段，也是野化放歸的基本前提。目前，在中國(guó)的動(dòng)物園中飼養(yǎng)黑鸛的數(shù)量約150只，主要集中在保定動(dòng)物園、石家莊動(dòng)物園、太原動(dòng)物園等。在過(guò)去20年中，黑鸛的飼養(yǎng)繁育技術(shù)不斷取得突破，種群已經(jīng)進(jìn)入平穩(wěn)增長(zhǎng)階段。

然而，隨著種群的增長(zhǎng)，種群管理的重要性逐漸凸顯出來(lái)。2011年中國(guó)動(dòng)物園協(xié)會(huì)物種保護(hù)委員會(huì)專門成立黑鸛保護(hù)委員會(huì)，并建立了黑鸛的譜系簿。根據(jù)譜系記錄，目前種群建群者22只，潛在建立者38只。種群發(fā)展早期因?yàn)閷Ｗ⒂诜敝吵晒β?，園際種源調(diào)配開展的較少，各個(gè)動(dòng)物園的種群總體上呈現(xiàn)相互隔離、近交的狀態(tài)。到2017年底，近交系數(shù)平均0.034 4，建群者遺傳多樣性保存量為19.36。按照目前的種群狀況，基因多樣性保持在90%以上，僅能維持13年。因此，當(dāng)前最為迫切的是解決遺傳管理問(wèn)題，以保持種群的質(zhì)量和遺傳多樣性。

當(dāng)前種群的遺傳管理需要解決如下幾個(gè)問(wèn)題：第一，譜系的確證和勘誤。當(dāng)前的譜系是根據(jù)動(dòng)物園中原始記錄整理而成，而人工記錄難免有疏失、遺漏甚至錯(cuò)誤。這類原始資料的錯(cuò)誤是無(wú)法矯正的。因此，需要建立一些新的方法來(lái)矯正這些錯(cuò)誤，并在后續(xù)的譜系續(xù)寫中確保信息正確。第二，建群者之間的實(shí)際關(guān)系在當(dāng)時(shí)是不清楚的，因此作為無(wú)關(guān)個(gè)體對(duì)待。這樣，譜系本所有的遺傳統(tǒng)計(jì)都有可能存在偏倚，影響管理決策。第三，黑鸛體色不太豐富，個(gè)體識(shí)別信息較少，從出生到長(zhǎng)成的變化往往影響對(duì)個(gè)體的準(zhǔn)確識(shí)別，形成譜系的錯(cuò)誤來(lái)源。第四，群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)中，基于譜系本的統(tǒng)計(jì)僅是表觀統(tǒng)計(jì)值，受信息誤差的影響大，需要更加精準(zhǔn)的分析工具和統(tǒng)計(jì)方法來(lái)支持精準(zhǔn)管理。

基于DNA的分子遺傳學(xué)分析能夠提供更為精準(zhǔn)的遺傳信息，是精準(zhǔn)管理的重要工具。微衛(wèi)星(microsatellites)是基因組上短串聯(lián)重復(fù)序列，因重復(fù)次數(shù)不同而呈現(xiàn)出高度多態(tài)性，因其突變率高、分布廣泛且均勻、多態(tài)性高、共顯性標(biāo)記、選擇中性、易檢測(cè)、分型重復(fù)性好、取樣范圍大、統(tǒng)計(jì)方法多樣等優(yōu)點(diǎn)，在群體遺傳研究、親緣鑒定等方面得到了廣泛的應(yīng)用，涵蓋了水產(chǎn)、家禽家畜、糧食作物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、稀有物種、昆蟲等各個(gè)研究領(lǐng)域[32-36]。

傳統(tǒng)的微衛(wèi)星多態(tài)性分析依靠PCR技術(shù)。但是，作為引物區(qū)的微衛(wèi)星側(cè)翼序列在不同的物種之間有可能相同，也可能不同。因此，同一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)有時(shí)表現(xiàn)出近緣物種間的通用性，有時(shí)也表現(xiàn)出物種的特異性。根據(jù)這一特點(diǎn)，從近緣物種的微衛(wèi)星中能夠篩選到目標(biāo)物種的微衛(wèi)星[35-36]。相比構(gòu)建文庫(kù)從頭篩選，這是一種低成本的策略。

目前為止，尚未有黑鸛微衛(wèi)星的報(bào)道，為了解決黑鸛人工飼養(yǎng)種群的上述管理問(wèn)題，本研究通過(guò)對(duì)黑鸛近緣物種微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選了適合于黑鸛的位點(diǎn)，并針對(duì)我國(guó)當(dāng)前黑鸛人工飼養(yǎng)種群進(jìn)行了群體遺傳特征的分析，探究其在黑鸛種群中的適用性。

1 材料與方法

1.1 樣品及總DNA提取

在北京動(dòng)物園的協(xié)助下，從保定動(dòng)物園和太原動(dòng)物園共采集了72只黑鸛個(gè)體。在2017年11月對(duì)黑鸛進(jìn)行疫苗注射的同時(shí)，在翅下靜脈取靜脈血約0.5 mL，置于1.5 mL離心管中，以EDTA-Na2抗凝(終濃度1.5 mg/mL)，放在冰盒中預(yù)存。血液樣品運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室后，每個(gè)樣品取5滴(約100 μL)均勻滴在DNA血樣采集卡上，避光靜置，干燥后置于陰涼處保存?zhèn)溆谩２捎肁xyPrep基因組DNA小量試劑盒(Axygen，抗州)提取總DNA。用NanoPhotometer-N50紫外分光光度計(jì)(Implen，Germany)測(cè)定DNA濃度，統(tǒng)一稀釋至10 ng/μL左右，4℃存放備用。

1.2 PCR擴(kuò)增

本研究采用近緣物種交叉擴(kuò)增的方法獲得黑鸛微衛(wèi)星。根據(jù)GenBank中已報(bào)道的微衛(wèi)星位點(diǎn)，結(jié)合黃赟[37]、張偉[36]、Wang[38]、Shephard[39]、Tomasulo-seccomandi[40]等人的文獻(xiàn)，選取白鸛(Ciconiaciconia)、東方白鸛(Ciconiaboyciana)、林鸛(Mycteriaamericana)和大藍(lán)鷺(Ardeaherodias)4個(gè)物種中，擴(kuò)增效果較好的29個(gè)微衛(wèi)星共30對(duì)引物(表1)，以黑鸛DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。在所有位點(diǎn)的上游引物5′端均加入一段M13序列(5′-GGAAACAGCTATGACCAT-3′)[41]，同時(shí)，單獨(dú)合成M13接頭序列并加上Fam熒光標(biāo)記。所有引物及接頭序列均由哈爾濱擎科生物公司(TSINGKE)合成。PCR擴(kuò)增采用北京全式金公司(TransGen Biotech)生產(chǎn)的TransStart TopTaq DNA Polymerase，擴(kuò)增采用15 μL體系(表2)。所有位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃/4 min，(94℃/30 s，Ta/40 s，72℃/30 s)×30 cycles，72℃/5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增效果PCR產(chǎn)物用ABI3100型遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.3 基因分型

毛細(xì)管電泳得到的是微衛(wèi)星等位基因擴(kuò)增片段的觀測(cè)值[42]，利用毛細(xì)管電泳的這一特性，對(duì)各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行初步分型。毛細(xì)管電泳檢測(cè)的結(jié)果用GeneMapper軟件讀取，獲得毛細(xì)管電泳的峰圖和每個(gè)信號(hào)峰的片段長(zhǎng)度。按照來(lái)源物種重復(fù)單元的提示信息，將片段長(zhǎng)度轉(zhuǎn)換為等位基因。等位基因數(shù)據(jù)輸入Excel表格后，導(dǎo)入Cervus 3.0中，分析各個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(NA)、觀測(cè)雜合(Ho)度、期望雜合度(He)和多態(tài)信息量(PIC)等信息。

2 結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，共18個(gè)位點(diǎn)有明確的符合微衛(wèi)星片段大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，占篩選位點(diǎn)總數(shù)的60%。其余位點(diǎn)或是難以出現(xiàn)清晰條帶，或是雜帶過(guò)多而影響后續(xù)的毛細(xì)管電泳結(jié)果分析，亦或是擴(kuò)增條帶過(guò)大(>500 bp)，難以判斷是否為微衛(wèi)星產(chǎn)物。

毛細(xì)管電泳顯示，在上述18個(gè)位點(diǎn)中，Cc01位點(diǎn)的峰值過(guò)低，干擾峰過(guò)多，無(wú)法對(duì)其基因型進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷，故舍棄。其余位點(diǎn)均有明確的，符合預(yù)期的等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物，但是，Cc05、Cc06、WSμ13、WSμ14、Cbo102、Cbo121、Cbo133、Cbo151、Cbo168和Ah208都只有一個(gè)等位基因。其余7個(gè)位點(diǎn)Cc02、Cc03、Cc04、Cc07、Cc10、Cc37和Cc42有2—8個(gè)等位基因，占可擴(kuò)增位點(diǎn)的35.3%(表1)。

Cc03、Cc37和 Cc42各發(fā)現(xiàn)2個(gè)等位基因，多態(tài)信息含量(PIC)僅有0.211—0.375，在群體分析中所能提供的遺傳信息較少。Cc02有4個(gè)等位基因，PIC為0.497，He為0.561，可以提供較多的遺傳信息。Cc04、Cc07、Cc10 3個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)(NA)在7—8個(gè)，PIC分別為0.518、0.731和0.784。在當(dāng)前群體中，Cc02、Cc04、Cc07、Cc10都符合H-W平衡(P=0.088—0.601)，說(shuō)明等位基因頻率分布比較符合隨機(jī)交配，為群體遺傳學(xué)指標(biāo)的計(jì)算提供更多、更可靠的信息。

表1 微衛(wèi)星位點(diǎn)信息Tab.1 Information of microsatellites selected for cross amplification in the black stork Ciconia nigra

續(xù)表1

注：“*”表示重復(fù)單元之間含有一個(gè)堿基；“+”表示兩個(gè)重復(fù)單元之間存在幾個(gè)隨機(jī)堿基；a和b表示同一個(gè)位點(diǎn)的不同引物；PIC一列中，“()”中的數(shù)字表示等位基因個(gè)數(shù)；“—”表示數(shù)據(jù)未知；未標(biāo)明出處位點(diǎn)的均來(lái)自GenBack
Note：“*” stands for repeating motif interrupted by a single nucleotide.“+” stands for repeating motif interrupted by several random nucleotides.“a” and “b” stand for one locus has different primers.In thePICcolumn，the figures in “()” stands for allele.“—” stands for the date unknown.the locus that are not marked are from GenBack

表2 微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增體系Tab.2 Components of PCR system of microsatellites

3 討論

微衛(wèi)星的側(cè)翼序列具有保守性，這是近緣物種間微衛(wèi)星位點(diǎn)交叉擴(kuò)增的基礎(chǔ)。鳥類研究中，采用近緣種交叉擴(kuò)增來(lái)篩選和使用微衛(wèi)星在雞形目(Galliformes)和雀形目(Passeriformes)比較集中[37]。特別是雞形目，得益于家雞的全基因組序列的成功測(cè)序和注釋，有超過(guò)900個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)和分析[35]，為雞形目其他物種的微衛(wèi)星交叉測(cè)試和遺傳管理應(yīng)用提供了極大地便利。然而，鸛形目鳥類的基因組始終沒(méi)有測(cè)定，報(bào)道的微衛(wèi)星主要是通過(guò)建庫(kù)和探針篩選獲得的，總體數(shù)量非常有限，因此，對(duì)于黑鸛可借用的位點(diǎn)數(shù)就更少了。

本文從白鸛、東方白鸛、林鸛、大藍(lán)鷺4個(gè)物種中，選擇多態(tài)性好、擴(kuò)增效果穩(wěn)定的29個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，測(cè)試在黑鸛的可用性。結(jié)果顯示，同屬的物種，微衛(wèi)星擴(kuò)增成功率和多態(tài)性均高于關(guān)系較遠(yuǎn)的物種。比較表1和表3可知，白鸛微衛(wèi)星有69.2%(9/13)能夠在黑鸛成功擴(kuò)增，53.8%表現(xiàn)出多態(tài)性(NA≥2)，同屬的東方白鸛的微衛(wèi)星有71.4%(5/7)能夠在黑鸛成功擴(kuò)增，但無(wú)一具有多態(tài)性。在林鸛和大藍(lán)鷺這兩個(gè)系統(tǒng)關(guān)系較遠(yuǎn)的物種，微衛(wèi)星在黑鸛成功擴(kuò)增率分別為33.3%和25.0%，但成功擴(kuò)增位點(diǎn)均無(wú)多態(tài)性。

這表明一種趨勢(shì)，近緣種基因組序列相似度高，微衛(wèi)星成功交叉擴(kuò)增的概率高，而遠(yuǎn)緣種之間情況則相反。但是交叉擴(kuò)增成功率與多態(tài)性沒(méi)有必然的聯(lián)系，而是取決于不同物種進(jìn)化歷史的相似性。微衛(wèi)星是基因組上非常活躍的組件，所發(fā)生的進(jìn)化事件會(huì)靈敏的反應(yīng)在多態(tài)性上，不同物種經(jīng)歷的進(jìn)化事件不同，同一個(gè)位點(diǎn)，即使側(cè)翼序列沒(méi)有變化，但多態(tài)性上會(huì)有顯著不同。這就為采用交叉擴(kuò)增來(lái)獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)。

盡管如此，本研究還是篩選到4個(gè)可用的黑鸛微衛(wèi)星位點(diǎn)，分別是Cc02、Cc04、Cc07、Cc10，這些位點(diǎn)擴(kuò)增效果穩(wěn)定，多態(tài)信息含量高，等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡，可作為黑鸛群體遺傳學(xué)分析和遺傳管理之用。

表3 17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在人工飼養(yǎng)黑鸛種群中的遺傳特點(diǎn)*Tab.3 Characteristics of 17 microsatellites in the captive black stork Ciconia nigra population*

續(xù)表3

*注：Cc01位點(diǎn)的峰值過(guò)低，干擾峰過(guò)多，無(wú)法準(zhǔn)確分型，故舍棄
*Note：Cc01 was discarded due to low target signals and complex untargeted signals that risk genotyping