唐 丹 楊 波 張志忠，3 王 一 朱 濤 吳代福林冰森 周季秋 瞿桂麗 李登翯 黃 炎*

(1.中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心，都江堰，611830；2.大熊貓國(guó)家公園珍稀動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，都江堰，611830；3.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物保護(hù)司，北京，100714；4.沈陽(yáng)森林動(dòng)物園管理有限公司，沈陽(yáng)，110164)

近年來(lái)動(dòng)物應(yīng)激成了野生動(dòng)物保護(hù)的研究重點(diǎn)，是動(dòng)物健康和福利的重要指標(biāo)。應(yīng)激過(guò)大會(huì)對(duì)動(dòng)物造成免疫系統(tǒng)、生殖能力以及生長(zhǎng)發(fā)育等方面的影響[1]。因此，針對(duì)不同的刺激源，研究動(dòng)物對(duì)其的應(yīng)激反應(yīng)大小，是動(dòng)物保護(hù)工作重要的一環(huán)。運(yùn)輸應(yīng)激作為其中一種應(yīng)激因素，在圈養(yǎng)野生動(dòng)物中發(fā)生頻次較多，但卻缺乏系統(tǒng)而全面的研究[2]，主要集中在亞洲象(Elephasmaximus)[3-4]，虎(Pantheratigris)[5]、野馬(Equuscaballus)、斑鬣狗(Crocutacrocuta)[6]等的研究上。

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)作為中國(guó)特有的重點(diǎn)保護(hù)物種，對(duì)其應(yīng)激源的研究主要集中在熱源[7-8]，游客干擾[9]，麻醉[8]，噪音[10-11]、光照[12]、環(huán)境[13]等方面，并未見(jiàn)運(yùn)輸應(yīng)激相關(guān)的研究，而實(shí)際的飼養(yǎng)管理工作中，如繁殖配對(duì)，大熊貓旅居海外，放歸轉(zhuǎn)運(yùn)等，都需要運(yùn)輸大熊貓。因此，研究長(zhǎng)途運(yùn)輸對(duì)于大熊貓應(yīng)激反應(yīng)具有實(shí)際意義。

1 研究對(duì)象

研究對(duì)象為19只大熊貓(16♀，3♂)，運(yùn)輸工具為汽車(chē)且運(yùn)輸時(shí)間均在2 h以上，裝載籠箱長(zhǎng)126 cm，寬65 cm，高74 cm。根據(jù)年齡將研究對(duì)象劃分為2組：Ⅰ：0—10歲，Ⅱ：10—20歲。實(shí)驗(yàn)期間健康狀況良好。

2 研究方法

2.1 樣品采集及預(yù)處理

從運(yùn)輸前7 d開(kāi)始逐日采集每一只大熊貓個(gè)體的糞便樣品，持續(xù)至運(yùn)輸后第10天，共計(jì)18 d。運(yùn)輸當(dāng)天的糞便樣品全部采集，運(yùn)輸前后的樣品每日采集1次，采樣時(shí)間集中在9：00—11：00，為避免樣品污染，使用PE手套采集樣品后立即放入樣品密封袋，并詳細(xì)記錄名稱(chēng)、日期、時(shí)間和地點(diǎn)等信息。然后按個(gè)體分別放入-20℃冰箱保存。樣品采集完畢后，用真空冷凍干燥機(jī)(ThermoMODULYOD-230)干燥糞便至恒重，揉碎后取粉末部分保存于-80℃冰箱中。

表1 研究對(duì)象的基本信息Tab.1 Basic information of the giant pandas in the study

2.2 皮質(zhì)醇激素的提取與測(cè)定

2.2.1 皮質(zhì)醇的提取

稱(chēng)取0.09—0.1 g糞便粉末放入10 mL 離心管中，加入5 mL 90%乙醇，震蕩20 min，然后1 500 rpm離心20 min，取上清液并移入10 mL 試管，再加入5 mL 90%乙醇，重復(fù)震蕩離心取上清液，將收集到的上清液置于30℃水浴中待乙醇完全揮發(fā)，加入3 mL無(wú)水乙醇，再次完全揮發(fā)后加入1 mL溶解液，充分震蕩，再移入500 μL 離心管中，保存于-20℃ 的冰箱中待檢測(cè)。

2.2.2 皮質(zhì)醇的測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定待測(cè)樣品中皮質(zhì)醇含量。大致步驟為：將二抗(Sigma R2004-5 Anti-Rabbit IgG)包被至酶標(biāo)板，配制標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋樣品，并用洗液清洗過(guò)的包被酶標(biāo)板，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、酶免反應(yīng)酶HRP以及抗體2，孵育90 min后取出洗板，加酶免反應(yīng)底物TMB，顯示反應(yīng)30 min后，加入H2SO4終止反應(yīng)，最后在酶標(biāo)儀(BioTek Elx800)上進(jìn)行讀數(shù)。

2.2.3 數(shù)據(jù)分析

激素濃度表示為Mean±SE。經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，激素濃度不遵循正態(tài)分布與方差齊性，故采用非參數(shù)檢驗(yàn)法(Kruskai-Wallis test)。

3 結(jié)果

3.1 運(yùn)輸對(duì)大熊貓糞便皮質(zhì)醇水平的影響

以運(yùn)輸前7 d(-7—-1 d)皮質(zhì)醇濃度作為大熊貓?bào)w內(nèi)皮質(zhì)醇正常水平值(278.68±21.92)ng/g，與運(yùn)輸后皮質(zhì)醇濃度做比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，運(yùn)輸當(dāng)天皮質(zhì)醇濃度開(kāi)始顯著升高(667.64±114.57)ng/g，P=0.006，運(yùn)輸后第1天皮質(zhì)醇濃度有所下降，第2天再次上升至(621.72±206.92)ng/g，P=0.006。第3天皮質(zhì)醇濃度恢復(fù)至運(yùn)輸前水平(184.42±32.22)ng/g，P=0.533。(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)運(yùn)前后各時(shí)間段大熊貓個(gè)體皮質(zhì)醇濃度變化Fig.1 Fecal cortisol concentrations of giant pandas for each time for block

從個(gè)體情況看，運(yùn)輸個(gè)體F13在運(yùn)輸后第一天皮質(zhì)醇水平達(dá)到峰值(圖3)，而運(yùn)輸個(gè)體F12則在運(yùn)輸后第二天達(dá)到峰值(圖2)。

圖2 個(gè)體F12轉(zhuǎn)運(yùn)前后各時(shí)間段大熊貓個(gè)體皮質(zhì)醇濃度變化Fig.2 Fecal cortisol concentrations of F12 for each time for block

圖3 個(gè)體F13轉(zhuǎn)運(yùn)前后各時(shí)間段大熊貓個(gè)體皮質(zhì)醇濃度變化Fig.3 Fecal cortisol concentrations of F13 for each time for block

3.2 運(yùn)輸對(duì)不同年齡大熊貓糞便皮質(zhì)醇的影響

比較2個(gè)年齡組間皮質(zhì)醇水平變化情況，從圖4中可以看出，第Ⅰ組(0—10歲)在轉(zhuǎn)運(yùn)當(dāng)天到第2天皮質(zhì)醇濃度明顯升高(P<0.05)，而第Ⅱ組(10—20歲)運(yùn)輸后皮質(zhì)醇濃度沒(méi)有出現(xiàn)明顯的升高(P>0.05)。

圖4 轉(zhuǎn)運(yùn)前后各年齡組大熊貓個(gè)體皮質(zhì)醇濃度變化Fig.4 Fecal cortisol concentrations of giant pandas between different age for each time for block

4 討論

已有許多研究揭示了運(yùn)輸刺激對(duì)野生動(dòng)物應(yīng)激狀態(tài)的影響。無(wú)運(yùn)輸經(jīng)驗(yàn)的老虎在長(zhǎng)途運(yùn)輸后的3—6 d皮質(zhì)醇水平達(dá)到最高，約為運(yùn)輸前的4倍[5]。雄性斑鬣狗運(yùn)輸后的第3天皮質(zhì)醇達(dá)到峰值，第4天恢復(fù)至正常水平[6]。雄性亞洲象經(jīng)過(guò)近24 h的運(yùn)輸，皮質(zhì)醇激素在2 d后達(dá)到峰值，增幅高達(dá)389%[3]。

不同物種運(yùn)輸應(yīng)激情況有所不同，同一物種不同個(gè)體運(yùn)輸應(yīng)激情況也有不同。在我們得到的數(shù)據(jù)中，每個(gè)大熊貓個(gè)體皮質(zhì)醇水平變化情況也有不同，如運(yùn)輸個(gè)體F13在轉(zhuǎn)運(yùn)后第1天皮質(zhì)醇水平增高至峰值2 260 ng/g(圖3)，而運(yùn)輸個(gè)體F12在運(yùn)輸后的第2天皮質(zhì)醇水平才達(dá)到峰值13 340 ng/g(圖2)。而皮質(zhì)醇到達(dá)峰值的時(shí)間不同，是由于我們檢測(cè)的為糞便中的激素濃度，激素分泌后需隨食物從消化道中排出，而不同動(dòng)物個(gè)體腸道蠕動(dòng)時(shí)間不同，導(dǎo)致激素峰值時(shí)間的不同。非洲象(Loxodontaafricana)的研究表明，一只亞成年非洲象在注射完促腎上腺皮質(zhì)激素后，20—25 h后即可檢測(cè)到糞便中皮質(zhì)醇激素的峰值[14]，而一只老年非洲象在注射完促腎上腺皮質(zhì)激素后，46 h后才能檢測(cè)出糞便中的皮質(zhì)醇激素峰值[15]。而理論上糞便中皮質(zhì)醇濃度的變化會(huì)有一定延遲性，但我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸當(dāng)天皮質(zhì)醇濃度便開(kāi)始迅速升高，可能是由于運(yùn)輸當(dāng)天糞便樣品較多，多數(shù)樣品采集時(shí)間跨度超過(guò)10 h，應(yīng)激性強(qiáng)的個(gè)體在運(yùn)輸當(dāng)天中后期激素就已升高。另外個(gè)別運(yùn)輸個(gè)體在運(yùn)輸前(工作人員準(zhǔn)備轉(zhuǎn)運(yùn)籠等準(zhǔn)備工作時(shí))已受到驚擾，表現(xiàn)出一定應(yīng)激性。

當(dāng)考慮年齡因素時(shí)，第Ⅰ組(0—10歲)在運(yùn)輸后表現(xiàn)出了明顯的應(yīng)激性，而第Ⅱ組(10—20歲)運(yùn)輸后皮質(zhì)醇濃度沒(méi)有顯著性的升高。我們分析這是由于第Ⅰ組的個(gè)體年紀(jì)較小且多數(shù)為首次運(yùn)輸，沒(méi)有運(yùn)輸經(jīng)驗(yàn)，對(duì)運(yùn)輸刺激較敏感，應(yīng)激反應(yīng)明顯。而第Ⅱ組15歲以上的大齡熊貓較多，且它們中多數(shù)已有豐富的運(yùn)輸經(jīng)驗(yàn)，運(yùn)輸不能造成明顯的刺激作用。有研究表明動(dòng)物有無(wú)運(yùn)輸經(jīng)驗(yàn)會(huì)直接影響應(yīng)激反應(yīng)的大小[16]且動(dòng)物通常對(duì)陌生的刺激源表現(xiàn)出更大的應(yīng)激反應(yīng)[17]。由于此次實(shí)驗(yàn)個(gè)體多為雌性大熊貓，無(wú)法體現(xiàn)性別因素對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激的影響。

盡管機(jī)體的應(yīng)激程度分為3個(gè)不同的階段[18]，內(nèi)分泌活動(dòng)的變化為第一個(gè)階段，但運(yùn)輸后大熊貓皮質(zhì)醇激素的顯著升高足以說(shuō)明運(yùn)輸激發(fā)了大熊貓?bào)w內(nèi)應(yīng)激機(jī)能的啟動(dòng)，這為以后深層次的大熊貓應(yīng)激研究打下基礎(chǔ)，同時(shí)為大熊貓的圈養(yǎng)保護(hù)工作提供了理論依據(jù)，在一定程度上指導(dǎo)實(shí)際的保護(hù)研究工作，比如，在每年的大熊貓繁殖季節(jié)，由于發(fā)情期間大熊貓身體狀況的特殊性，應(yīng)盡量減少對(duì)發(fā)情期大熊貓的運(yùn)輸，如特殊原因需要運(yùn)輸，最好提前一周進(jìn)行運(yùn)輸，減少運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)大熊貓繁殖造成影響。在大熊貓野化放歸研究中，為了避免大熊貓因?yàn)檫\(yùn)輸產(chǎn)生更嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，也要減少運(yùn)輸，運(yùn)輸后保持安靜等方法，保證大熊貓良好的身體狀況，提高大熊貓放歸后的存活率。