曾文軍　王柳均　梅艷娟　鄧珍良　皮紅泉　陳群

【摘要】 目的：探討解脲支原體（UU）不同生物亞群、抗子宮內(nèi)膜抗體（AEMAb）與女性不孕患者的關(guān)系。方法：選取本院2017年2月-2018年2月100例不孕女性為不孕組，同期選取100例健康孕婦為對(duì)照組，兩組均行UU培養(yǎng)，通過聚合酶鏈反應(yīng)并以多條帶抗原基因?yàn)榘形辉O(shè)計(jì)引物將檢測(cè)到的UU進(jìn)行分群，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)AEMAb，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果：不孕組UU及其UU2生物亞群與AEMAb陽性率均明顯高于對(duì)照組（P<0.01），不孕組以UU2生物亞群為主，對(duì)照組以UU1生物亞群為主，而兩組UU1生物亞群比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。不孕組AEMAb陽性者UU及UU2生物亞群感染率明顯高于AEMAb陰性者（P<0.01），兩者UU1生物亞群比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：女性不孕的發(fā)生與UU及AEMAb有關(guān)，UU1生物亞群可能是定植菌群，而UU2生物亞群則更易導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生AEMAb引起不育。

【關(guān)鍵詞】 解脲支原體; 生物亞群; 抗子宮內(nèi)膜抗體; 聚合酶鏈反應(yīng); 不孕

【Abstract】 Objective：To study the association between biovars of ureaplasma urealyticum （UU） and antiendometrium antibody（AEMAb） in infertile women.Method：100 infertile women in our hospital from February 2017 to February 2018 were selected as infertile group，at the same time 100 healthy pregnant women were selected as control group，they were given UU cultured.The detected UU was grouped by polymerase chain reaction and primers were designed with multiple antigen genes as targets.AEMAb was detected by ELISA，and the correlation analysis was carried out.Result：There were significant differences in positive rate of UU，UU2 and AEMAb between infertility group and control group（P<0.01）.Biovar UU1 was the main biovar in control group and infertility group were mainly infected with biovar UU2.No significant difference was found in biovar UU1 between two groups（P>0.05）.The positive rate of AEMAb in positive UU and biovar UU2 were significantly higher than that of negative rate of AEMAb（P<0.01），but biovar UU1 was no significant difference in infertility group（P>0.05）.Conclusion：It is suggested that infertile women is closely correlated with UU and AEMAb;UU1 is the colonized biovar，UU2 may be cause infertility easily because of inducing AEMAb.

【Key words】 Ureaplasma urealyticum; Biovars subgroup; Antiendometrium antibody; Polymerase chain reaction; Infertility

First-authors address：Dongguan Changping Hospital Affiliated of Jinan Universty，Dongguan 523573，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.01.035

解脲支原體（UU）是女性宮頸寄居最常見的微生物之一，具有一定的致病性，按照不同的生物表型及基因特征分為UU1（即Parvo生物群，包括1、3、6、14四種血清型）與UU2（即T960生物群，包括2、4、5、7-13十種血清型）兩種生物亞群，而且不同的生物亞群可能與宮頸盆腔炎癥、不孕不育、早產(chǎn)流產(chǎn)、新生兒肺炎有關(guān)[1]?？棺訉m內(nèi)膜抗體（AEMAb）是以子宮內(nèi)膜為靶抗原并引起一系列免疫反應(yīng)的自身抗體，與免疫性不孕關(guān)系密切，它的產(chǎn)生有諸多學(xué)說，但生殖道微生物感染是誘因之一[2]。本研究采用分子生物學(xué)檢測(cè)UU不同生物亞群及AEMAb與女性不孕關(guān)系，旨在為臨床診治及優(yōu)生優(yōu)育提供一定依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2017年2月-2018年2月符合女性不孕標(biāo)準(zhǔn)（未采取避孕措施正常同居2年以上而未妊娠）患者100例為不孕組，年齡22～40歲，平均（29.1±4.2）歲。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①無器質(zhì)性病變;②夫妻生活正常;③月經(jīng)正常;④配偶精液正常。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他細(xì)菌及病毒感染;②遺傳性疾病、先天不育不孕及排卵障礙;③外傷及手術(shù)史、嚴(yán)重內(nèi)科疾患、癌癥病史;④配偶精液異常。選取本院同時(shí)期具有可比性的100例健康孕婦為對(duì)照組，年齡23～41歲，平均（28.9±3.9）歲（P>0.05）。參與者均知曉同意并簽署知情同意書，且該研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 SU-CF-IF型凈化工作臺(tái)，PCR儀，電熱恒溫水箱，Clinibio 128C酶標(biāo)儀，國產(chǎn)洗板機(jī)，紫外線燈，UU液體及固體培養(yǎng)基，UU3（UU1生物亞群）及UU8（UU2生物亞群）標(biāo)準(zhǔn)菌株。PCR反應(yīng)試劑盒及DNA marker，DNA引物，瓊脂糖，AEMAb試劑。

1.3 AEMAb檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)，空腹抽取靜脈血3 mL分離血清-20 ℃保存?zhèn)溆?。測(cè)定時(shí)血清作1︰100稀釋，加稀釋血清100 μL至包被孔內(nèi)，并作陰陽性對(duì)照各一孔，經(jīng)溫浴、洗滌、顯色等步驟，最后加終止液終止顯色，450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度（OD）值。P/N≥2.1者為陽性（P：待測(cè)血清OD值，N：陰性對(duì)照OD值。當(dāng)N<0.1時(shí)，則以0.1計(jì)）。

1.4 UU檢測(cè)培養(yǎng)及生物群鑒定 （1）UU檢測(cè)培養(yǎng)：收集宮頸拭子標(biāo)本，經(jīng)分離、純化、鑒定、培養(yǎng)增殖后置-20 ℃醫(yī)用冰箱備用。（2）菌株DNA提?。鹤葬t(yī)用冰箱中取出臨床標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)菌株，解凍后吸取500 μL液體，10 000 r/min離心15 min，吸取上清液;加入100 μL的蛋白酶K溶液;55 ℃水浴1 h;95 ℃保溫滅活蛋白酶K 10 min;10 000 r/min?離心1 min，取上清液作PCR。（3）PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳：以多條帶抗原基因?yàn)榘形辉O(shè)計(jì)分群引物進(jìn)行鑒定，并設(shè)空白對(duì)照。UU分群引物上游為5-GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG-3;下游為5-CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTC-3。UU1及UU2生物亞群擴(kuò)增產(chǎn)物分別為403 bp、448 bp。PCR反應(yīng)體系為20 μM引物各2 μL，3 U/μL Taq酶1 μL，10×PCR Buffer （含Mg2+）5 μL，3 mM dNTP，混合物5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O?40 μL，總反應(yīng)體積100 μL。PCR反應(yīng)設(shè)為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組UU及其生物亞群與AEMAb檢測(cè)對(duì)比 不

孕組AEMAb檢測(cè)率30.00%，健康對(duì)照1.00%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=4.62，P<0.01）。不孕組UU及UU2生物亞群明顯高于對(duì)照組（字2=14.74、25.25，P<0.01），不孕組以UU2為主，對(duì)照組以UU1為主，而UU1兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=0.18，P>0.05）。見表1。本研究未發(fā)現(xiàn)兩生物亞群混合感染的標(biāo)本。

2.2 不孕組患者UU及其生物亞群與AEMAb的關(guān)系 AEMAb在UU1生物亞群比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=0.005，P>0.05），而AEMAb陽性者的UU及UU2生物亞群感染率均顯著增高（字2=9.79，P<0.01;字2=30.47，P<0.01）。見表2。

3 討論

影響生殖健康的病因繁多，表現(xiàn)復(fù)雜，其中微生物感染與免疫不孕是重要因素之一。近年來，UU檢出率不斷上升，作為一種條件致病菌，當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變或免疫變化時(shí)，定植于宿主黏膜表面會(huì)釋放出NH3、各種磷脂酶、蛋白水解酶、過氧化物等毒性代謝產(chǎn)物導(dǎo)致機(jī)體損傷和炎癥反應(yīng)[4]。本研究不孕組UU陽性率43%，對(duì)照組18%，兩者差異有顯著性，說明不孕與UU一定相關(guān)，和以往研究類似[4-5]。女性感染UU不僅引起炎癥損傷，輸卵管纖毛運(yùn)動(dòng)減弱甚至堵塞，還會(huì)吸附于精子表面，降低精子質(zhì)量使畸形率增高，導(dǎo)致精子對(duì)卵子的穿透能力下降，此外UU與精子有相似抗原導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生抗精子抗體，從而引致不孕發(fā)生率增高[4-5]，故有學(xué)者建議育齡婦女不孕癥要進(jìn)行UU篩查及治療。

正常情況下，育齡女性周期性剝脫子宮內(nèi)膜隨著月經(jīng)排出體外，具有一定的免疫耐受性而不會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自身免疫性抗體。AEMAb是一種專門針對(duì)子宮內(nèi)膜的自身特異性抗體，抗原抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜免疫病理損傷而發(fā)育不良，是影響女性不孕的重要原因之一。本研究不孕組AEMAb檢測(cè)率30.00%，健康對(duì)照1.00%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明AEMAb在不孕中起重要作用。AEMAb產(chǎn)生后可抑制排卵、阻礙精卵結(jié)合與運(yùn)送、干擾胚胎著床及影響早期胚胎的發(fā)育，導(dǎo)致不孕不育及早產(chǎn)流產(chǎn)的發(fā)生。AEMAb的產(chǎn)生除與子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜炎有關(guān)外，而且與流產(chǎn)后內(nèi)膜損傷及泌尿生殖道炎癥關(guān)系密切。本研究中，女性不孕患者AEMAb陽性者的UU感染率明顯高于AEMAb陰性者，以往研究亦提示女性不孕患者AEMAb、抗精子抗體、抗透明帶抗體的產(chǎn)生與UU的感染有顯著關(guān)系，可以誘發(fā)女性的免疫性不孕，其可能機(jī)制為微生物感染后大量炎癥細(xì)胞聚集并吞噬受損子宮內(nèi)膜，觸發(fā)抗原提呈反應(yīng)[6-7]。李會(huì)平等[2]研究證明，積極治療UU生殖道感染有助阻止抗體形成，抗精子抗體及抗子宮內(nèi)膜抗體轉(zhuǎn)陰率升高，使受孕機(jī)會(huì)增高。

雖然大多數(shù)研究結(jié)果認(rèn)為UU與不孕不育存在一定關(guān)系，但是也有研究證明不孕組與對(duì)照組支原體感染患病率并無差異，沒必要把UU作為不孕患者的常規(guī)篩查[8]。UU在性成熟女性宮頸分離率較高，即使經(jīng)過治療轉(zhuǎn)陰，經(jīng)過一段時(shí)間的正常性行為又會(huì)轉(zhuǎn)陽[9]，臨床急需進(jìn)一步研究如何判斷UU是感染還是攜帶狀態(tài)。作為條件致病微生物，UU致病影響因素主要有三方面：與生物亞群、血清型相關(guān);與致病因子、UU濃度及感染時(shí)間相關(guān);與宿主狀態(tài)有關(guān)[1]。

UU包括2個(gè)生物亞群，它的致病性與生物亞群密切相關(guān)，多數(shù)研究?jī)A向于UU2有一定的致病力，更容易導(dǎo)致宮頸盆腔炎、不孕不育及早產(chǎn)流產(chǎn)，而UU1可能是優(yōu)勢(shì)定植菌群而無明顯致病性[1，9]。梁旭東等[11]研究發(fā)現(xiàn)，UU2在異位妊娠中檢出率顯著高于對(duì)照組，組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為更易導(dǎo)致輸卵管纖毛粘附、倒伏、減少甚至脫落的病變。辛亞維等[12]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不孕患者中UU2生物亞群檢出比率高于正常女性，而UU1檢出率組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這可能與UU2促單核細(xì)胞分泌巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）的能力高于UU1，MIF的增加使機(jī)體產(chǎn)生炎癥和組織損傷。錢迎芬[13]研究亦發(fā)現(xiàn)，UU2具有毒性作用，UU1不具備毒性作用，引發(fā)炎癥是兩個(gè)亞群比例失調(diào)所致。本研究發(fā)現(xiàn)不孕組以UU2為主，對(duì)照組UU1為主，而UU1兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;不孕組UU2感染致AEMAb陽性者更高（P<0.01），但UU1差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），所以UU2更易導(dǎo)致不孕，更容易誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫抗體，支持上述觀點(diǎn)。Kwak等[14]研究發(fā)現(xiàn)，性工作者UU2所占比例為正常女性的5倍，更容易出現(xiàn)生殖系統(tǒng)炎癥，而在正常女性UU2所占比例較小而不會(huì)出現(xiàn)病理特征，可能原因之一為UU2的致病因子或致病島對(duì)宿主破壞性更大，致病性更強(qiáng)。筆者早期研究也發(fā)現(xiàn)，男女不孕不育患者UU2與抗精子抗體關(guān)系更密切[15-16]，更容易導(dǎo)致不孕不育，因此臨床分群對(duì)診療甚為必要。治療方面，多西環(huán)素對(duì)UU兩大生物群敏感性均較高，UU2較UU1有更高的耐藥性[17]。然而學(xué)術(shù)界亦有不同聲音，有研究表明UU不同生物亞群、血清型與致病性并不存在特殊的相關(guān)性及區(qū)別，這可能與樣本、取材部位、地域、實(shí)驗(yàn)方法、人群、種族差異有關(guān)，UU生物群致病性的多因素性和復(fù)雜性值得今后進(jìn)一步探討研究[18-20]。

綜上所述，UU1生物亞群可能是定植優(yōu)勢(shì)菌群，而UU2生物亞群則更易導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生AEMAb引起不育。臨床開展UU分型分群，不但可以有的放矢進(jìn)行臨床診治，而且對(duì)保障生殖健康具有重要意義。

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（收稿日期：2018-05-18） （本文編輯：周亞杰）