張留超，何雄文，牛美蘭

(1.黃河科技學(xué)院藥理教研室，河南 鄭州 450063； 2.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004)

腦水腫是指水在腦組織細胞內(nèi)外的異常蓄積，是腦缺血損傷后常見的并發(fā)癥之一，也是致殘、致死的重要原因[1]。缺血性腦水腫發(fā)生機制尚未完全清楚，是國內(nèi)外研究熱點，其中，Na+-K+-2Cl-聯(lián)合轉(zhuǎn)運蛋白1型(Na+-K+-2Cl-combined transporter type 1，NKCC1)被認為在缺血性腦水腫中有著關(guān)鍵作用。已有研究證實，大鼠腦缺血模型的星形膠質(zhì)細胞 NKCC1的轉(zhuǎn)錄及表達水平均會顯著上調(diào)；當予以 NKCC1的特異性抑制劑后其表達下降，并且血-腦屏障損害及神經(jīng)毒性均會減輕[2-3]。生姜是姜科植物姜 (ZingiberofficinaleRosc.)的新鮮根莖。研究表明，生姜具有較強的抗氧化、清除自由基、抗缺氧和缺血再灌注損傷等作用[4-5]。然而，生姜是否能夠通過調(diào)控NKCC1的表達水平，減輕缺血性腦水腫癥狀，從而發(fā)揮對大鼠缺血性腦損傷的保護作用尚不明確。本研究通過線栓法構(gòu)建大鼠大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型，通過病理學(xué)檢測和腦含水量測定，觀察生姜對MCAO腦缺血再灌注模型大鼠NKCC1的影響，探討生姜對大鼠缺血性腦水腫的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級6～8周齡雄性大鼠30只，體質(zhì)量約210 g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，質(zhì)量許可證號為SCXK(蘇)2018-0001，以商業(yè)飼料為食，在無病原環(huán)境中飼養(yǎng)。實驗得到鄭州大學(xué)倫理委員會批準。

1.2 藥品、試劑與儀器

生姜購于河南省商丘市夏邑縣曹集鄉(xiāng)。參照文獻方法[6]將其洗凈去皮，切碎后按1∶1 (W/V) 加入蒸餾水，榨汁機壓榨，用3層紗布過濾后，4 000 r/min 離心15 min，取上清液(生藥含量1 g/mL)，避光儲存于4 ℃冰箱備用。臨用時用蒸餾水分別稀釋配成100，200，400 g/L 3種質(zhì)量分數(shù)。兔抗NKCC1抗體(批號YS-17824R)和鼠抗β微管蛋白抗體(批號ANT-019 )，購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；羊抗兔LgG(H+L)Alexa Fluor 594標記二抗(批號111-585-003)，山羊抗小鼠IgG H&L (IRDye? 680RD)預(yù)吸附二抗(批號33218ES60)和羊抗兔IRDye? 680抗體(批號926-68071)，購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。其余試劑均由Sigma-Aldrich公司提供。

1.3 動物分組與給藥

將大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型對照組，生姜高、中、低劑量組5組，每組6只。生姜高、中、低劑量組依次給予生姜10，20，40 μL/g，假手術(shù)組、模型對照組給予等容積生理鹽水10 μL/g。均灌胃給藥，1 d 1次，連續(xù) 5 d。

1.4 大腦中動脈缺血再灌注模型的建立

末次灌胃 30 min 后，參照線栓法[7]建立模型。將直徑為 0.26 mm市售尼龍漁線剪成 6 cm 長，消毒備用。以質(zhì)量分數(shù) 100 g/L 水合氯醛3.5 μL/g 腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，沿頸正中切開皮膚，鈍性分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈；結(jié)扎頸外動脈，夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈；自頸總與頸內(nèi)動脈分岔口上端的頸總動脈上剪口，插入備好的尼龍漁線進入頸內(nèi)動脈到達大腦中動脈，插入的深度為 20～25 mm，遇到阻力時停止；固定線栓，縫合。造模 2 h后觀察大鼠行為。另設(shè)假手術(shù)組作為對照，制作步驟同手術(shù)組，但血管分離后不插線栓。缺血 2 h 后抽出線栓實現(xiàn)再灌注。將造模成功的大鼠隨機分為模型對照組，生姜高、中、低劑量組。按造模前給藥方法繼續(xù)給藥5 d。

1.5 檢測指標

1.5.1 取 材

末次給藥后的第10天，進行神經(jīng)功能評分，然后脫頸椎處死各組大鼠，取腦。每組取3只大鼠的右側(cè)腦組織分裝于凍存管中，立即放入液氮凍存，隨后放-80 ℃ 冰箱凍存，供Western-Blot 檢測使用。另外3只大鼠右側(cè)腦組織采用40 g/L多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)法進行脫水、透明、石蠟包埋，冠狀位切片，供組織病理學(xué)檢查和免疫熒光法檢測。

1.5.2 神經(jīng)功能評分

根據(jù)文獻[7]標準進行。無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀、活動正常者計0分，不能完全伸展對側(cè)前爪者計1分，爬行時出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈者計2分，行走時身體向偏癱側(cè)傾倒者計3分，不能自發(fā)行走、意識喪失者計4分。

1.5.3 腦組織病理學(xué)檢查

石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇至ddH2O，蘇木素染色4 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇分色2 s，自來水洗后酸化伊紅復(fù)染2 min，水洗，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.4 腦組織含水量

分離右側(cè)大腦半球，稱濕重后，再置于80 ℃烤箱中烤至恒重后，稱干重，計算腦組織含水量。含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5.5 NKCC1蛋白

采用Western-Blot法檢測NKCC1蛋白。取少量缺血皮質(zhì)，提取其總蛋白，對蛋白進行定量，常規(guī)法進行Western-Blot操作，以Image Studio Lite Ver 4.0分析圖像結(jié)果。β-Actin為內(nèi)參計算相對值。每組實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分對比

與假手術(shù)組對比，模型對照組大鼠神經(jīng)功能評分增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，生姜高、中劑量組神經(jīng)功能評分減少，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；生姜低劑量組較之差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組 別n神經(jīng)功能評分/分假手術(shù)組60.00±0.00模型對照組63.04±0.18???生姜高劑量組62.56±0.16###生姜中劑量組62.69±0.12###生姜低劑量組62.98±0.21#

注：與假手術(shù)組對比，***P<0.01； 與模型對照組對比，#P>0.05， ###P<0.01。

2.2 各組大鼠腦組織病理學(xué)檢查對比

假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細胞排列整齊，毛細血管內(nèi)皮細胞正常、連接緊密、組織致密。模型對照組大鼠腦組織病理改變明顯，可見明顯的組織水腫，在缺血中心區(qū)域可見較多壞死組織，面積大，呈篩網(wǎng)狀。生姜各劑量組大鼠腦組織的病理學(xué)改變有所改善，其中高、中劑量組改善效果較為明顯。見圖1。

圖1各組大鼠腦組織病理學(xué)對比(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠腦含水量對比

與假手術(shù)組對比，模型對照組大鼠腦組織含水量增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，生姜高、中劑量組腦組織含水量均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；生姜低劑量組較之差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

組 別n濕重/g干重/g水含量/%假手術(shù)組60.665±0.0240.146±0.00478.00±0.51 模型對照組60.716±0.0220.148±0.00679.37±0.33???生姜高劑量組60.684±0.0340.149±0.00478.21±0.58###生姜中劑量組60.690±0.0270.148±0.00478.45±0.95##生姜低劑量組60.702±0.0210.147±0.00379.03±0.56#

注：與假手術(shù)組對比，***P<0.01；與模型對照組對比， #P>0.05，###P<0.05，###P<0.01。

2.4 各組大鼠腦組織NKCC1Western-Blot法檢查對比

與假手術(shù)組對比，模型對照組和生姜各劑量組大鼠腦組織NKCC1蛋白表達水平升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，生姜各劑量組的NKCC1蛋白表達均降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與生姜低劑量組對比，高劑量組的NKCC1蛋白表達降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而中劑量組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組 別nNKCC1/(g·L-1)假手術(shù)組60.250±0.045模型對照組61.022±0.077???生姜高劑量組60.544±0.088??? ###△△△生姜中劑量組60.753±0.099???###△生姜低劑量組60.845±0.107???###

注：與假手術(shù)組對比，***P<0.01；與模型對照組對比，###P<0.01；與生姜低劑量組對比， △P>0.05，△△△P<0.01。

3 討 論

生姜具有良好的抗氧化活性，對缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷具有保護作用[2-4]。本研究采用線栓法建立大鼠MCAO再灌注模型[6]，結(jié)果模型大鼠均出現(xiàn)對側(cè)前爪不能完全伸展，向?qū)?cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)損傷癥狀；此外，病理組織學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組大鼠對比，MCAO再灌注模型大鼠腦組織病理改變明顯，表明大鼠神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷，造模成功。與假手術(shù)組對比，生姜各劑量組大鼠腦組織病理改變有所減輕，神經(jīng)功能評分下降，提示生姜可以緩解缺血再灌注所致的神經(jīng)細胞損傷，具有一定的神經(jīng)保護功能。模型對照組腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組，生姜高、中劑量給藥能夠有效降低腦組織含水量，提示生姜能夠緩解腦組織水腫癥狀，這可能是生姜對缺血性腦損傷的保護機制之一。

腦水腫是腦缺血損傷后腦細胞死亡的主要原因之一。腦缺血后由于病理性刺激、離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白表達異常[8-9]，細胞內(nèi)外離子濃度失衡，細胞滲透性改變，細胞發(fā)生腫脹，進而引起細胞損傷[10]。NKCC1是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的離子轉(zhuǎn)運蛋白，在腦組織有廣泛表達，主要分布在微血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的細胞膜上，調(diào)控Na+-K+-2Cl-的平衡，對維持血腦屏障通透性、保持星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞內(nèi)正常離子濃度，以及細胞容積的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)有重要作用[11]。腦缺血缺氧后，能量代謝障礙加重[12]，活性氧、細胞外高鉀和炎癥因子等因素均可上調(diào)NKCC1，進一步導(dǎo)致Na+內(nèi)流增多，而水通過滲透壓差轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。有研究[2-3]發(fā)現(xiàn)：大鼠大腦中動脈阻塞后，腦梗死灶周圍NKCC1的表達均明顯增加，腦水腫加重；抑制NKCC1的表達可以減輕腦梗死面積，同時降低腦缺血造成的腦水腫風(fēng)險。 生姜可以抗氧化，減輕炎癥損傷[14-15]，并能夠緩解缺氧和腦缺血再灌注損傷，但是生姜是否能夠通過降低NKCC1的表達水平從而緩解缺血性腦水腫尚未見報道。因此本研究通過線栓法建立MCAO再灌注大鼠模型，通過免疫熒光法和Western-Blot法檢測，發(fā)現(xiàn)：MCAO組大腦組織NKCC1蛋白的表達水平均明顯升高，而生姜高、中劑量均能有效降低NKCC1蛋白的表達水平。結(jié)合神經(jīng)功能評分、病理學(xué)檢查和腦含水量的研究結(jié)果，認為生姜可能通過降低NKCC1蛋白的表達水平，減輕腦水腫癥狀，發(fā)揮對缺血性腦損傷的保護作用。

總之， MCAO再灌注大鼠表現(xiàn)出嚴重的神經(jīng)功能障礙，腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶并伴有腦組織含水量升高，NKCC1蛋白表達水平均明顯升高。生姜高、中劑量能明顯改善MCAO大鼠神經(jīng)病學(xué)癥狀，顯著縮小腦梗死面積，降低腦組織含水量，降低NKCC1表達水平，提示生姜減輕腦組織水腫和神經(jīng)損害癥狀可能與抑制NKCC1的表達有關(guān)。