黃江 楊云芳（通訊作者） 周姜 白雪 趙福蘭

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 四川 瀘州 646000）

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，患者生存率低，目前尚無(wú)有效的藥物能夠治愈該疾病[1]，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了極大的負(fù)擔(dān)。Aβ的沉積導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮損傷可能是AD發(fā)病機(jī)制之一，可能與Aβ致血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)有關(guān)[2]。TLR4是機(jī)體參與炎癥信號(hào)的重要受體之一[3]，特異性配體可以激活TLR4與COX-2信號(hào)通路，釋放炎癥因子IL-1、TNF-α[4]。

加味益氣聰明湯主要含黃芪、人參、葛根、石菖蒲、遠(yuǎn)志等中藥，現(xiàn)代研究表明其具有神經(jīng)功能保護(hù)作用[5]，對(duì)阿爾茨海默病具有一定的改善作用。據(jù)此筆者通過(guò)體外培養(yǎng)HBMEC，研究加味益氣聰明湯是否能減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的HBMEC凋亡，探討其保護(hù)效應(yīng)與TLR4/COX-2表達(dá)的關(guān)系，為加味益氣聰明湯臨床用于AD治療提供分子藥理學(xué)依據(jù)。

1.材料

1.1 儀器

電泳轉(zhuǎn)膜儀；超凈工作臺(tái)；酶標(biāo)儀；激光掃描顯微鏡；流式細(xì)胞儀。

1.2 藥品與試劑

加味益氣聰明湯按要求提取純化并制成每1ml相當(dāng)于原藥材1g的藥液；CCK-8試劑盒；兔TLR4、COX-2多克隆抗體；Aβ1-42；TAK242；Hochest33342、FITC。

1.3 細(xì)胞

人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HBMEC）。

2.方法

2.1 細(xì)胞活力的測(cè)定

將各組細(xì)胞均加入50μmol·L-1Aβ1-42培養(yǎng)24h，同時(shí)加味益氣聰明湯各濃度組加入相應(yīng)濃度的藥液作用30min，24h后加入CCK-8 10μL繼續(xù)培養(yǎng)1h。酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD），以O(shè)D值的大小評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。

2.2 細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)及凋亡率的測(cè)定

同“2.1”項(xiàng)下分組、給藥培養(yǎng)24h后，Hochest 33342/PI雙染檢測(cè)HBMEC凋亡情況，藍(lán)色為正常細(xì)胞，亮藍(lán)色為凋亡細(xì)胞，紅色為死亡細(xì)胞；培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，冷PBS洗2次，懸浮于緩沖液中，取100μL細(xì)胞懸液加5μL AnnexinⅤ-FITC和5μL PI，室溫暗置15min，流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡率。

2.3 細(xì)胞中TLR4、COX-2蛋白表達(dá)的測(cè)定

同“2.1”項(xiàng)下分組給藥培養(yǎng)24h，裂解10min，低溫離心10min，取上清液備用。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3.結(jié)果

3.1 細(xì)胞活力

陰性對(duì)照組、對(duì)照組和加味益氣聰明湯各濃度組細(xì)胞的OD值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組細(xì)胞活性及凋亡率檢測(cè)結(jié)果 （）

表1 各組細(xì)胞活性及凋亡率檢測(cè)結(jié)果 （）

注：對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05；藥物組與對(duì)照組比較，#P＜0.05。

組別 細(xì)胞活力OD值 細(xì)胞凋亡率（%）陰性對(duì)照組 0.99±0.12 0.97±0.11對(duì)照組 0.79±0.07* 19.69±0.08*加味益氣聰明湯低濃度組 0.92±0.04# 10.32±0.06#加味益氣聰明湯中濃度組 0.97±0.03# 5.02±0.02#加味益氣聰明湯高濃度組 0.99±0.07# 2.11±0.04#

3.2 細(xì)胞凋亡情況及凋亡率

Hochest雙染結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，幾乎無(wú)凋亡細(xì)胞；對(duì)照組多數(shù)細(xì)胞細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，提示凋亡細(xì)胞較多，偶見(jiàn)紅色細(xì)胞核的死亡細(xì)胞；加味益氣聰明湯高濃度組凋亡細(xì)胞較少，加味益氣聰明湯中、低濃度組可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞。

流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，加味益氣聰明湯各濃度組細(xì)胞的凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各組細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 細(xì)胞中TLR4、COX-2 蛋白表達(dá)

與陰性對(duì)照組比較，對(duì)照組細(xì)胞中TLR4、COX-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，加味益氣聰明湯各濃度組細(xì)胞中TLR4、COX-2蛋白表達(dá)均明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。各組細(xì)胞中TLR4、COX-2 蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞中TLR4、COX-2 蛋白表達(dá)的測(cè)定結(jié)果（）

表2 各組細(xì)胞中TLR4、COX-2 蛋白表達(dá)的測(cè)定結(jié)果（）

注：對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；藥物組與對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 TLR4/β-actin值 COX-2/β-actin值陰性對(duì)照組 0.71±0.11 0.83±0.11對(duì)照組 0.94±0.06** 1.11±0.08**加味益氣聰明湯低濃度組 0.88±0.03## 0.95±0.04##加味益氣聰明湯中濃度組 0.81±0.04## 0.92±0.02##加味益氣聰明湯高濃度組 0.72±0.04## 0.86±0.06#

4.討論

Toll受體是機(jī)體重要的識(shí)別受體之一，目前發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體約有12種[6]。其中TLR4是識(shí)別特異性配體LPS，參與炎癥信號(hào)的重要受體之一。TLR4激活后，會(huì)激活下游COX-2通路，釋放炎癥因子參與炎癥反應(yīng)[7]。有資料顯示，AD的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能與TLR4的參與關(guān)系密切[8]，LPS啟動(dòng)的TLR4通路參與了AD的發(fā)生[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4缺乏的小鼠較TLR4野生型小鼠更容易發(fā)生淀粉樣沉積和彌散。由此可知，TLR4可能與AD發(fā)生過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞損傷存在一定關(guān)聯(lián)。

研究發(fā)現(xiàn)加味益氣聰明湯對(duì)改善AD神經(jīng)功能癥狀具體一定的療效[10]，可能對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的HBMEC細(xì)胞凋亡具有保護(hù)效應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ1-42刺激HBMEC后，細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞活力下降；與對(duì)照組比較，加味益氣聰明湯作用后減少了Aβ1-42誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，提高了細(xì)胞活力，因此加味益氣聰明湯對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的HBMEC凋亡具有一定的保護(hù)效應(yīng)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，加味益氣聰明湯作用后減少了Aβ1-42誘導(dǎo)的HBMEC中TLR4、COX-2蛋白表達(dá)，推測(cè)其對(duì)AD的保護(hù)效應(yīng)可能與抑制TLR4、COX-2 蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，加味益氣聰明湯對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的HBMEC細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)效應(yīng)，其保護(hù)效應(yīng)可能與抑制TLR4啟動(dòng)的信號(hào)通路中COX-2蛋白表達(dá)有關(guān)，但其他的Toll受體是否也參與了加味益氣聰明湯的保護(hù)作用值得進(jìn)一步研究。