施晉升，李峰，吳思慧，俞力超，劉黎瓊，于峰

（1.江蘇大學附屬醫(yī)院心胸外科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；3.深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院血液科，廣東深圳5180052；4.江蘇大學生命科學研究院，江蘇鎮(zhèn)江212013；5.上海市腫瘤研究所癌基因及相關基因國家重點實驗室，上海200032）

肺癌的常規(guī)放化療方案毒副反應明顯且敏感度不高，靶向免疫治療逐漸成為肺癌治療策略之一。腫瘤微環(huán)境對腫瘤發(fā)生、進展以及治療具有重要作用［1］。成纖維細胞是腫瘤微環(huán)境中重要的基質細胞，成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）表達于 90%以上的基質成纖維細胞［2］。單純靶向腫瘤細胞治療的效果不甚理想，而靶向FAP陽性的腫瘤基質細胞能增強抗腫瘤效果［3］。

溶瘤病毒是一類經過基因改造后能選擇性在腫瘤細胞內復制增殖，裂解腫瘤細胞后子代又能擴散到臨近腫瘤細胞的病毒。該類病毒因特異性強、副反應小而成為腫瘤靶向治療的新型工具［4］。目前已經有10余種溶瘤病毒用于臨床試驗，例如腺病毒、皰疹病毒和牛痘病毒（vaccinia virus，VV）等。牛痘病毒因其良好的安全性而被廣泛應用于臨床，例如作為疫苗消滅天花。此外，由于牛痘病毒具有溶瘤速度快、外源基因承載能力大（約25 kb）、溶瘤同時激發(fā)機體抗腫瘤免疫應答等優(yōu)點成為溶瘤病毒的典型代表［5］。雖然臨床研究顯示，溶瘤痘病毒及其激活的免疫反應能在腫瘤組織被檢測到，但其抗腫瘤效果仍不理想［6］。為了增強抗腫瘤效果，我們構建了攜帶抗FAP和抗小鼠CD3分子雙特異性分子（BiTE.FAP）的重組溶瘤痘病毒（recombinant oncolytic double deleted vaccinia virus-Bispecific T cell Engager-FAP，rVVDD-BiTE.FAP），并在體外檢測其對過表達FAP蛋白小鼠肺癌細胞的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料

痘苗生長因子（vaccinia growth factor，VGF）基因缺失的親本病毒vSC20、rVVDD-GFP病毒、pCDHFAP-GFP慢病毒質粒、pSEL2N1質粒、非洲綠猴腎CV-1細胞株、人骨肉瘤HuTK-143B細胞株由本實驗室保存；小鼠肺癌LLC細胞株和小鼠肺癌LL/2細胞株購于南京凱基生物公司；LLC-GFP和LLCFAP細胞株是本課題組采用慢病毒轉導構建而成的穩(wěn)定細胞株；8～12周SPF級C57BL/6小鼠，雌雄不限，體重20～22 g，由江蘇大學實驗動物中心提供（合格證號：201607173）；胎牛血清（美國 Gibco公司）；RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基（上海 HyClone公司）；轉染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；BudR（美國Sigma公司）；限制性內切酶NotI和EcoR V（美國NEB公司）；PCR擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；MTS試劑盒（北京Promega有限公司）；基因組抽提試劑盒及LDH試劑盒購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；IL-2和IFN-γ濃度檢測用ELISA試劑盒（美國BD公司）。

1.2 pSEL2N1-BiTE-FAP重組質粒的構建

以pSEL2N1空載質粒為模板擴增PSEL-DsRed基因。所用的引物序列：PSEL-DsRed，上游5′-AATTCAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAAATGGCCTCCTCCGAGAAC-3′，下游5′-GGTATCTTGCGGGATATCCTACAGGAACAGGTGGTG-3′。以pCDH-FAP-GFP質粒為模板擴增PFl7R-BiTE-FAP基因。所用引物序列：PFl7R-FAP，上游5′-TTCAATTTTTGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATGAACTCAGGACTCCAATTGGTTTTC-3′，下游：5′-ATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCACGCCCGTTTTATTTCCAGCT-3′。PCR擴增程序：98℃20 s；98℃ 15 s，60℃15 s，72℃ 30 s；72℃ 5 min；30個循環(huán)。將痘病毒早晚期啟動子 PSEL、EcoR V位點分別引入DsRed基因的上下游引物，而NotⅠ位點和痘病毒特異性啟動子F17R分別引入BiTE-FAP基因的上下游引物。pSEL2N1質粒原來的DsRed和GPT基因閱讀框用NotⅠ和EcoR V雙酶切切去。PCR產物、pSEL2N1骨架質粒 DNA片段切膠回收。將DsRed和BiTE-FAP基因用 Infusion克隆法插入pSEL2N1質粒，構建表達紅色熒光的重組質粒pSEL2N1-BiTE-FAP。

1.3 重組病毒rVVDD-BiTE.FAP的構建

消化CV-1細胞，以3.0×105/孔密度接種于6孔板，當細胞匯合度達80%時，將原培養(yǎng)液更換為2 mL含2%胎牛血清的培養(yǎng)基，用MOI值為0.05的vSC20感染，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，將感染液更換為完全培養(yǎng)基，利用Lipofectamine 2000將重組質粒 pSEL2N1-BiTE-FAP轉染 CV-1細胞。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡下觀察DsRed的表達，以確定質粒轉染和病毒轉導效果。細胞完全病變時收集細胞及培養(yǎng)液，反復凍融3次，1 000×g離心10 min，收集病毒上清液，保存于-80℃冰箱。

1.4 重組病毒的篩選和純化

消化HuTK-143B細胞，以3.0×105/孔密度接種于6孔板；當匯合度達90%時，將原培養(yǎng)液更換為2 mL含2%胎牛血清的培養(yǎng)基，然后分別加入1、10、50μL病毒上清液，置細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后棄感染液；將含50μg/mL BudR的完全培養(yǎng)基和1%低熔點瓊脂糖加入6孔板中覆蓋細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。熒光顯微鏡下觀察紅色熒光，并將DsRed陽性的病毒斑挑于1 mL PBS中；-80℃冰凍及37℃恒溫水浴融解3次后4℃1 000×g離心30 min，收集上清液進行下一輪空斑純化。經過5輪篩選及純化后，在熒光顯微鏡下驗證其純度。

1.5 重組病毒滴度的檢測

消化CV-1細胞，以1.5×105/孔密度接種于24孔板培養(yǎng)，分為6組，每組設3個復孔；當匯合度達90%時，取6份1μL病毒液，按比例（10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8）稀釋后加入24孔板中；37℃5%CO2培養(yǎng)48 h后棄上清液，加入適量結晶紫染液染色5 min，PBS洗2次后風干，以空斑數(shù)計算重組病毒的滴度。

1.6 重組病毒體外復制能力檢測

LLC、LL/2細胞經0.25%胰酶消化后，分別以1×105/孔細胞密度接種于48孔板，每種細胞分2組，每組設3個復孔，共種4塊板。細胞培養(yǎng)過夜，當達90%匯合度時，用MOI=0.1的rVVDD-BiTE.FAP和親本病毒vSC20分別感染LLC、LL/2細胞，并在0，24，48，72 h收獲，反復凍融3次后通過CV-1細胞空斑計算病毒滴度。

1.7 MTS法檢測兩株重組病毒的體外溶瘤能力

LLC細胞經0.25%胰酶消化后，將細胞分為5組，均以細胞密度1×104/孔接種于96孔板中，每組設3個復孔，培養(yǎng)過夜。當細胞達90%匯合度時，將rVVDD-GFP和rVVDD-BiTE.FAP按 MOI值（0，0.01，0.1，1和10）稀釋后加入96孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，加入100μL新培養(yǎng)基，另設3孔空白對照組（不含細胞及病毒）作為調零孔。將MTS試劑按MTS∶PMS=20∶1的比例混合，并計算所需總體積。每孔加入配置好的混合液20μL，避光置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 h后用酶標儀檢測490 nm處的D值。細胞存活率=（病毒感染孔D值-凋零孔D值）/（對照孔D值-凋零孔D值）×100%。

1.8 結晶紫染色觀察活細胞數(shù)量

將“1.7”中培養(yǎng)板細胞棄上清液，用PBS輕洗1～2次，吸去PBS，加入適量結晶紫染液，室溫放置固定5 min后，再用PBS洗2次，每次靜置2 min，完全吸去PBS后于生物安全柜內風干，拍照記錄結晶紫染色結果，其顏色深淺代表活細胞數(shù)量。

1.9 痘病毒基因組制備及PCR鑒定

吸取20μL的病毒液，按照TaKaRa公司病毒基因組純化試劑盒的操作步驟抽提基因組DNA，并采用酶標儀定量。確認濃度后取出2 ng作為模板插入基因組片段 PCR，上游引物：5′-CGGCGGACATATTCAGTTGATAATCGG-3′，下游引物：5′-CGGTGGCACCATCTAATATACCGTGTCGCTGT-3′。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸4 min，反應30個循環(huán)后72℃再延伸5 min，然后4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.10 小鼠脾臟T細胞的制備

取6周齡C57雄性小鼠1只，斷頸法處死，解剖取出脾臟，置于滅菌篩子上，加少量PBS，用10 mL注射器的推進器橡膠頭小心研磨，再用PBS沖洗篩子，收集T細胞，置于15 mL離心管中。在管中按1∶1的比例加入紅細胞裂解液，置冰上5 min，然后以500×g離心5min，去上清液后用PBS重懸，再離心、重懸1次。T細胞第3次離心后用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，以2.5×106/mL細胞密度接種于培養(yǎng)皿，最后將刀豆蛋白A（Con A）以2.5 μL/mL加入培養(yǎng)皿用于活化T細胞。

1.11 重組病毒對過表達FAP的小鼠LLC細胞殺傷作用測定

先采用Con A活化小鼠脾臟T細胞。然后將MOI=5的rVVDD-BiTE.FAP感染LLC細胞，24 h后收集上清液，離心后用0.1μm濾膜過濾。將病毒過濾液在有或無活化T細胞的情況下分別與LLC-GFP或LLC-FAP細胞共培養(yǎng)。以無病毒過濾液的空培養(yǎng)液作為對照。具體步驟：LLC-GFP和LLC-FAP細胞經0.25%胰酶消化后，分別以2×104/孔細胞密度接種于96孔板中，每種細胞分為與T細胞、無T細胞共培養(yǎng)兩大組，每大組分3個小組，每小組設3個復孔，效應細胞∶靶細胞=3∶1，病毒過濾液∶培養(yǎng)基=40μL∶60μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察殺傷效果，然后用MTS和LDH實驗測定殺傷效果。LDH實驗參照說明書進行，設立未處理細胞組作為LDH本底釋放對照組（低對照），在細胞中加Triton X-100作為LDH完全釋放對照組（高對照）。LDH測定方法：將經病毒和T細胞處理的LLC細胞培養(yǎng)板以250×g離心10 min后，小心地從每個孔中取出100μL上清液并轉移到光學透明96孔板的相應孔中，向每個孔中加入100μL反應混合物，在室溫避光孵育30 min內，用酶標儀測定490 nm處D值。細胞毒性（抑制率）=（實驗孔D值-低對照D值）/（高對照D值-低對照D值）×100%。重復上述殺傷實驗并吸取上清液，按ELISA試劑盒說明檢測上清液中的細胞因子IL-2和IFN-γ的濃度。

1.12 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據。實驗結果用均數(shù)±標準差（x-±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒構建及重組溶瘤痘病毒基因組PCR驗證

PCR擴增膠回收的DsRed-PCR產物、FAP-PCR產物和pSEL2N1質粒雙酶切產物經電泳檢測，結果與理論值相符。見圖1。將構建好的質粒經酶切篩選后送上海生工生物工程公司測序驗證，獲得陽性重組質粒pSEL2N1-BiTE-FAP。

取出2 ng純化好的重組病毒基因組作為模板，插入基因組片段進行PCR。PCR程序結束后進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果與理論值相符，且未在電泳圖上看到親本病毒vSC20 PCR條帶位置處有明顯條帶擴增，說明已獲得高純度重組病毒。見圖2。

圖1 pSEL2N1-BiTE-FAP重組質粒構建電泳圖

圖2 重組病毒rVVDD-BiTE.FAP的PCR鑒定

2.2 BiTE-FAP表達不影響病毒復制和溶瘤能力

空斑法測定結果顯示，rVVDD-BiTE.FAP、vSC20感染LLC、LL/2細胞后，各時點的病毒滴度無明顯差異，表明重組痘病毒的復制能力未受到影響。見圖3。

圖3 vSC20、rVVDD-BiTE.FAP感染兩類小鼠肺癌細胞株不同時間后滴度

MTS實驗結果顯示，隨著MOI值增加，兩類病毒感染后的LLC細胞存活率均逐漸降低，且各滴度的兩者溶瘤能力均無顯著差異（P均＞0.05，圖4）。結晶紫染色也顯示上述趨勢（圖5）。

圖4 MTS實驗檢測不同MOI值重組病毒對LLC細胞存活率的影響

2.3 rVVDD-BiTE.FAP聯(lián)合小鼠T細胞具有高效抗癌作用

MTS實驗結果顯示，在與小鼠T細胞共培養(yǎng)的LLC-FAP體系中，rVVDD-BiTE.FAP具有明顯抗腫瘤效果，溶瘤效果明顯強于其他組（圖6）。結果說明BiTE-FAP介導T細胞殺傷FAP陽性腫瘤細胞。

圖5 兩類重組病毒不同MOI值下的溶瘤能力（結晶紫染色）

圖6 MTS檢測各組LLC細胞的存活率

LDH結果也顯示，rVVDD-BiTE.FAP聯(lián)合小鼠T細胞，對LLC-FAP細胞具有更強的毒性作用（圖7）。對共培養(yǎng)體系的上清液進行ELISA檢測，結果顯示rVVDD-BiTE.FAP能介導T細胞殺傷腫瘤細胞并釋放大量細胞因子IL-2和IFN-γ（圖8），T細胞殺傷靶細胞后細胞因子IL2和IFN-γ表達量明顯升高（P＜0.05）。

圖7 rVVDD-BiTE.FAP和rVVDD-GFP病毒對LLC-GFP和LLC-FAP細胞的抑制作用

3 討論

腫瘤微環(huán)境是具有異質成分的復雜環(huán)境，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及介導治療抗性中起重要作用［7-10］，因此，除了靶向癌細胞之外，靶向腫瘤微環(huán)境中的輔助細胞可以增加靶向治療的有效性［11］。FAP陽性癌相關成纖維細胞是腫瘤基質的中心細胞組分，并且對免疫抑制、基質發(fā)生、血管形成和細胞外基質重塑具有重要的促進作用［12］。Ostermann等［13］的臨床前研究顯示，靶向FAP的單克隆抗體能夠破壞腫瘤組織的成纖維細胞和血管結構，抑制腫瘤生長，而實驗小鼠無明顯毒副反應。然而，在臨床試驗中輸注FAP特異性單克隆抗體，患者未能從中獲益［14］。Tran等［15］報道，靶向 FAP的嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）在小鼠實驗中卻出現(xiàn)致死性骨毒性和惡病質的毒副反應，主要原因在于小鼠PDGFR-α和Sca-1陽性的多能骨髓基質細胞也大量表達FAP，導致CAR-T細胞出現(xiàn)脫靶作用。因此，在腫瘤微環(huán)境局部表達FAP抗體可避免T細胞出現(xiàn)這種脫靶副反應。VGF和TK雙缺失的溶瘤痘病毒不但具有腫瘤組織趨向性，而且能夠高水平表達外源插入基因。該研究旨在通過rVVDD-BiTE.FAP將FAP雙特異性抗體表達于腫瘤局部，避免T細胞的脫靶副反應。

圖8 ELISA法檢測共培養(yǎng)體系中IL-2和IFN-γ濃度

本研究將構建成功的重組溶瘤痘病毒rVVDDBiTE.FAP進行純化后，與Con A活化的T細胞共培養(yǎng)，檢測其對FAP過表達的LLC細胞的體外殺傷效果。結果顯示，重組病毒不僅保留了原本病毒體外復制及溶瘤能力，而且對FAP過表達細胞具有更強的殺傷作用。由于傳統(tǒng)療法治療實體瘤效果欠佳，攜帶靶向FAP雙功能抗體的溶瘤痘病毒不僅能夠裂解腫瘤細胞，而且能夠介導T細胞靶向殺傷腫瘤基質細胞，這種雙靶向治療機制為腫瘤治療提供了新思路。本研究證實了表達雙功能抗體的重組溶瘤病毒的體外殺傷能力，后期我們將在小鼠體內進一步證實該研究的可行性。