郁晶晶，卜妙然，孟令建，葉黎離，王軍

（徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科，江蘇徐州221002）

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是先天性病毒感染最常見的病原體之一，新生兒及小嬰兒屬于免疫功能低下的群體，故容易感染HCMV。HCMV常引起多系統(tǒng)播散性疾病或單一組織、器官損害。HCMV肝損傷多見于嬰幼兒期原發(fā)感染者，是由遺傳、免疫和環(huán)境等多種原因所致，臨床上通常表現為黃疸、肝脾腫大、肝功能異常［1］。

目前，HCMV發(fā)病機制尚不十分清楚，可能與機體免疫應答有關。既往研究顯示，HCMV感染是多種細胞因子及細胞參與的慢性感染，病毒與機體間相互作用導致機體免疫功能紊亂，而CD4+T細胞在此復雜的免疫應答過程中發(fā)揮著重要的效應。產生IL-17A的CD4+T細胞（helper T cells 17，Th17）和CD4+CD25+調節(jié)性T細胞（CD4+CD25+regulatory T cells，Treg）的發(fā)現打破傳統(tǒng)的Th1/Th2細胞效應模式［2］。IL-35是一種新發(fā)現的抗炎因子，是Treg細胞發(fā)揮免疫抑制作用的重要成分。IL-35與Treg細胞、Th17細胞及IL-17等免疫調節(jié)功能密切相關，通過多種途徑參與HCMV的發(fā)病與調節(jié)過程。

關于HCMV肝損后機體IL-17、IL-35和Th17/Treg水平變化及其臨床作用國內報道較少。本實驗通過檢測HCMV肝損傷組、非肝損組與健康對照嬰兒外周血Th17細胞和Treg細胞比例及相關細胞因子，探討其在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用，為HCMV肝損傷的臨床治療探索新的方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至10月在本院兒科診斷為HCMV感染伴肝損傷的20例患兒為肝損傷組，診斷標準參照2012年中華醫(yī)學會兒科學分會感染消化學組制定的《巨細胞病毒感染診斷方案》［1］，經PCR-DNA定量檢測尿液確診為HCMV病毒感染，均為初發(fā)未經抗病毒及免疫抑制劑治療病例，臨床主要以黃疸、肝功能異常就診。患兒年齡52～337 d，平均（179±64）d，男 12例、女 8例；其中，5例表現為單純肝功能損害，9例為單純黃疸，2例為黃疸合并肝功能損害，4例肝功能損害合并肝大。

另外選取同期在年齡、性別分布無統(tǒng)計學差異的38例門診體檢嬰兒，其中存在HCMV感染但無肝損者18例作為非肝損組，20例體檢正常嬰兒且排除HCMV感染者為對照組。3組的年齡、性別構成間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。所有入選者均排除膽道閉鎖、消化道畸形、其他類型病毒性肝炎（如甲、乙、丙肝炎病毒、EB病毒、風疹病毒、單純皰疹病毒等感染所致的肝炎）、遺傳代謝性疾病、藥物性肝炎等。

受試嬰兒家長均簽署知情同意書，本研究通過醫(yī)院學術倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

CD4-BB515抗體、APC-CD25抗體、PE-Foxp3抗體、IL-17A-PE抗體、白細胞激活劑組合、Transcription Factor Buffer Set購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；人IL-17、IL-35 ELISA試劑盒購自徐州康美生物科技有限公司；全自動生化儀與免疫分析儀由我院檢驗科提供；BD FACSCantoTMⅡ流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3 ELISA法檢測各組血清IL-17、IL-35濃度

采用EDTA抗凝管抽取實驗對象外周血2 mL，3 000 r/min離心10 min，留取血清標本分裝于EP管中，部分置-80℃冰箱凍存。按ELISA試劑盒說明書檢測IL-17和IL-35濃度。

1.4 血漿轉氨酶、尿HCMV-DNA載量檢測

上述EP管中部分血清采用全自動生化儀測定丙氨酸轉氨酶（ALT）水平；留取測試者3次混合尿液，由我院中心實驗室采用熒光免疫PCR法檢測尿HCMV-DNA載量。

1.5 流式細胞術檢測Treg細胞和Th17細胞比例

將上述剩余血標本用等量PBS液稀釋后，加入淋巴細胞分離液1 500 r/min離心20 min，棄上清液，取外周血單核細胞（PBMC）與2μL白細胞刺激劑至24孔板，培養(yǎng)基吹勻細胞后，置于培養(yǎng)箱孵育4 h（37℃、5%CO2），取出離心，棄上清液，將管內剩余物標記，加入50μL PBS，用微量加樣儀混勻吹打管內細胞，分別取2μL熒光標記抗體（CD4-BB515抗體、APC-CD25）加入標記為Treg管及Treg對照管，震蕩混勻后室溫避光孵育30 min；取1 mL PBS加入標記為Th17管及Th17對照管內，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加200μL甲醛于Th17對照管內重懸，置4℃冰箱避光保存；Th17管中加1 mL細胞固定液重懸，室溫避光孵育40 min后，用Wash破膜劑固定，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，用1 mL緩沖液洗滌細胞2次；上述4組試管分別加入50μLWash破膜劑，將2μL PE標記的IL-17 A抗體及2μL PE-Foxp3抗體置于相應實驗試管，同型對照管加入同型對照抗體進行染色，避光孵育50 min；各試管內加1 mL緩沖液洗滌后1 500 r/min離心5 min，棄上清液，采用流式細胞儀檢測Treg細胞、Th17細胞比例，設同型對照用于校正補償。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件分析數據，符合正態(tài)分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，非正態(tài)分布資料采用中位數表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用Pearson法對各項參數進行相關性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ALT和尿HCMV-DNA定量

肝損傷組患兒外周血ALT明顯高于非肝損組和對照組（P均＜0.05），非肝損組和對照組間無明顯差別（P＞0.05）。熒光免疫PCR法檢測結果顯示，肝損組與非肝損組間HCMV-DNA含量的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 3組嬰兒丙氨酸轉氨酶和尿HCMV-DNA定量比較

2.2 外周血Th17細胞比例、Treg細胞比例及相關細胞因子濃度

與對照組比較，肝損傷組、非肝損組血清Th17細胞比例、IL-17濃度均明顯增高，肝損傷組這兩項指標又顯著高于非肝損組（P均＜0.01）；肝損傷組、非肝損組外周血Treg細胞比例和IL-35濃度均明顯低于對照組，且肝損傷組又顯著低于非肝損組（P均＜0.01）。肝損傷組Th17/Treg明顯高于非肝損組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。見表2和圖1。

表2 各組嬰兒外周血Th17、Treg細胞比例及相關細胞因子濃度比較±s

表2 各組嬰兒外周血Th17、Treg細胞比例及相關細胞因子濃度比較±s

a：P＜0.05，與非肝損傷組比較；b：P＜0.05，與對照組比較

組別 n IL-17（pg/mL） IL-35（pg/mL） Th17細胞（%） Treg細胞（%）Th17/Treg肝損傷組 20 268.22±2.82a，b 41.73±6.02a，b 42.61±5.24a，b 3.59±0.61a，b 12.25±2.77a，b 75.828 28.347 47.209 40.472 39.43 P值非肝損組 18 217.48±1.58b 47.68±4.48b 32.91±5.98b 4.41±0.77b 7.60±1.67b對照組 20 182.62±1.98 57.02±8.18 26.90±4.17 6.65±1.01 4.11±0.70 F值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 流式細胞術檢測外周血Th17細胞和CD4+CD25+T細胞比例

2.3 相關性分析

外周血Treg細胞比例與IL-35濃度呈顯著正相關（r=0.620，P＜0.05）；外周血 Th17細胞比例與血清 IL-17濃度呈顯著正相關（r=0.830，P＜0.05）。

3 討論

肝臟是人體的重要靶器官，容易受外界環(huán)境、機體內部免疫紊亂的影響而發(fā)生病變。HCMV侵犯肝膽管上皮細胞、內皮細胞后，經抗原提呈和白細胞黏附作用，促使多種細胞參與機體免疫炎癥反應，進而加重肝臟損害［3-4］。

Th17細胞是近年來新發(fā)現的一種輔助細胞，維甲酸相關孤兒受體 ROR-γt是其主要轉錄因子。Th17細胞主要由胸腺合成，部分為TGF-β和IL-6誘導T細胞前體分化而成。Th17細胞通過分泌IL-17、IL-22及IL-23等效應因子參與炎癥反應、防御胞外病原菌感染［5］。IL-17主要啟動T細胞誘導的早期炎癥反應，參與免疫調節(jié)并發(fā)揮較強的炎癥介導功能［6］。研究表明，IL-17R是同源信號I型跨膜蛋白質受體，與IL-17結合后可促使產生IL-8和GRO-α，激活MAP激酶磷酸化等多種下游途徑［7］，同時招募大量的炎癥細胞，促進T細胞的激活。HCMV可激發(fā)相關細胞產生細胞因子，募集、活化中性粒細胞，同時刺激Th17細胞分泌IL-17，參與肝臟炎癥反應［8-9］。Yasumi等［10］曾提出 IL-17可作為肝臟急性損傷的標志。本實驗中，ELISA檢測結果顯示HCMV肝損患兒外周血中IL-17濃度顯著高于另外兩組，與孫曉紅等［3］的研究結果一致。因此我們認為IL-17可作為衡量HCMV肝損患兒的重要指標。

Treg細胞是機體負向免疫調節(jié)應答的重要細胞亞群，在病毒感染過程中通過產生高濃度IL-10和TCF-β等細胞因子，抑制T淋巴細胞及NK等細胞的增殖分化。IL-35是一種新型的抗炎細胞因子，2007年 Niedbala等［11］以及 Collison等［12］的小鼠體內實驗初步顯示，IL-35主要由Treg細胞分泌。IL-35一方面刺激Treg細胞增殖，另一方面誘導T細胞轉化為具有更強抑制活性的調節(jié)性T細胞［13］，構成機體強大的免疫調控網絡。

既往研究顯示IL-35在骨髓增生異常綜合征、乳腺癌、心血管等疾病中發(fā)揮重要作用。萬雪媛等［14］在小鼠模型實驗中提出，在MCMV感染急性期IL-35可抑制炎癥反應，而在急性感染所致的持續(xù)病理損傷過程中發(fā)揮著重要保護作用。本實驗結果顯示，HCMV感染肝損傷患兒Treg細胞比例與IL-35濃度明顯下降。因此，我們猜測Treg細胞、IL-35可能在HCMV感染中發(fā)揮重要免疫保護作用。

本研究顯示，HCMV肝損患兒Treg細胞比例較對照組下降，Th17/Treg平衡被打破，IL-17促進炎癥的發(fā)生發(fā)展，并在肝臟代謝中產生重要反應，從而形成惡性循環(huán)，最終導致機體免疫系統(tǒng)紊亂。Th17細胞與Treg細胞都來源于CD4+T細胞，既往研究證實Treg細胞在高濃度IL-6的刺激下可轉化成Th17細胞；另外，Treg細胞的特異性轉錄因子Foxp3與ROR-γt結合，可抑制IL-17 RNA的轉錄，從而影響Th17細胞的功能［15］。所以，Treg細胞與Th17細胞在分化及免疫應答方面存在相互拮抗作用。Th17細胞主要參與肝臟炎癥反應，而Treg細胞主要在慢性病毒感染中表達。有人提出，當出現重型肝炎時，機體Th17細胞及其分泌的IL-17濃度可顯著增加，參與炎癥反應致肝臟損傷；相應地Treg細胞分化增強，下調免疫反應從而避免肝臟過度損傷［16］；所以，Th17、Treg細胞在維持免疫內環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。IL-35能促進IFN-γ合成，并抑制Th17細胞增殖分化，減少IL-17的分泌，從而抑制機體過度的免疫損傷［17］。

綜上所述，在巨細胞病毒肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，存在多種細胞及細胞因子的參與。以IL-17為主的促炎因子和IL-35為主的抗炎介質引發(fā)一系列免疫反應，Th17/Treg的平衡在維持機體免疫內環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用。IL-35是一種具有潛在治療前景的新型調節(jié)因子，能否通過提高IL-35濃度來抑制炎癥反應有待探討；相信隨著對IL-35與HCMV關系的深入了解，IL-35在慢性病毒感染中將展現臨床應用前景。