徐振雷，王慶偉

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院1.燒傷整形科，2.檢驗科，江蘇淮安223001）

qkI基因編碼一組RNA結(jié)合蛋白的剪接異構(gòu)體，主要調(diào)控細胞分化［1-2］。在神經(jīng)祖細胞、肌細胞和單核細胞中，顫抖蛋白（Quaking，QKI）異常表達可導(dǎo)致細胞發(fā)生嚴重的分化缺陷［3-4］。qkI基因編碼3個主要的RNA結(jié)合蛋白，QKI-5，-6和-7，其C末端30個氨基酸不同；QKI-5 C端含有核定位序列，主要定位于細胞核中，QKI-6分布在整個細胞中并與QKI-5形成異源二聚體，QKI-7主要定位于細胞質(zhì)中［5］。QKI可作為預(yù)測結(jié)腸癌、肺癌、口腔癌和胃癌預(yù)后的生物標志物［6-9］，QKI-5通過Ras-MAPK信號通路抑制腎透明細胞癌的增殖和誘導(dǎo)細胞周期停滯［10］，也可以預(yù)測前列腺癌患者的預(yù)后［11］。但是，QKI-7在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不清楚。本研究擬觀察QKI-7在乳腺癌組織中的表達，并分析其與患者預(yù)后之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料與試劑

組織芯片購于上海芯超生物有限公司，共142例原發(fā)性乳腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞5.0 cm）。所有患者臨床病理資料和隨訪資料均完整，均為女性，年齡29～83歲，平均53.3歲；腫瘤直徑為0.5～15.0 cm，平均3.5 cm；其中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移90例；組織學(xué)類型：浸潤性導(dǎo)管癌134例，浸潤性導(dǎo)管癌伴浸潤性小葉癌7例，篩孔癌1例；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）乳腺癌TNM分期標準：Ⅰ期12例，Ⅱ期83例，Ⅲ期47例。手術(shù)前均未經(jīng)過放射治療、化學(xué)治療和靶向藥物治療，無遠處轉(zhuǎn)移；患者接受乳腺癌保乳手術(shù)或乳腺癌根治手術(shù)，手術(shù)時間為2001年1月至2004年8月，隨訪時間截止到2013年7月，隨訪9～13年。

小鼠抗人單克隆抗體QKI-7（上海文淵閣生物科技有限公司）；小鼠抗人P53和Ki-67抗體（美國Sigma公司）；兔抗小鼠二抗購于上海威奧生物科技有限公司；通用型免疫組化檢測試劑盒購于吉泰生物有限公司。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測QKI-7、P53和Ki-67的表達

采用SP免疫組織化學(xué)染色法，將組織芯片在80℃微波中加熱20 min；二甲苯浸泡脫蠟15 min；50%、70%、80%、95%梯度乙醇水化各2 min；PBS沖洗3次，每次5 min；3%過氧化氫固定10 min；置于95℃0.01mol/L枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）中煮沸15 min，行抗原修復(fù)；滴加正常山羊血清室溫封閉20min；滴加小鼠抗人QKI-7（1∶2 000）、P53（1∶1 000）、Ki-67（1∶1 000），4℃孵育過夜；滴加兔抗小鼠二抗（1∶1 000）室溫孵育 2 h；PBS洗 3次，每次 5 min；DAB顯色，脫水、透明、封片、鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

將組織芯片置于光鏡下觀察和評分，結(jié)果判斷綜合考慮低倍鏡下陽性細胞的染色強度和高倍鏡下陽性細胞所占比例。染色強度和陽性細胞百分比評分標準：基本不著色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。組織芯片置于顯微鏡下計數(shù)200個細胞，陽性細胞百分數(shù)＜10%為0分；10%～40%為1分；40%～70%為2分；≥70%為3分。兩者相加，0～2分為陰性；3～6分為陽性［12］。由2位有資質(zhì)的病理科醫(yī)師采用雙盲法進行判讀，陰陽性判斷不一致時，以第三位病理科醫(yī)師的判讀結(jié)果為準。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，QKI-7、P53及Ki-67在乳腺癌和癌旁組織中的陽性率比較采用χ2檢驗，QKI-7與P53和Ki-67表達相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，乳腺癌組織中QKI-7的陽性率與各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用Pearson、Fisher精確檢驗和似然比檢驗。采用Kaplan-Meier檢驗評估總生存期，組間生存時間的比較采用Log-Rank法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QKI-7在乳腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織中的表達比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，QKI-7主要位于細胞質(zhì)中，P53和Ki-67主要位于細胞核。乳腺癌組織中QKI-7陽性表達率（28.2%，40/142）明顯低于癌旁組織（78.9%，112/142，χ2=73.378，P＜0.05）。此外，乳腺癌組織中P53陽性表達率（21.8%，31/142）明顯低于癌旁組織（93.7%，133/142，χ2=150.139，P＜0.05），Ki-67陽性表達率（54.9%，78/142）明顯高于癌旁組織（17.6%，25/142，χ2=42.791，P＜0.05）。見圖1。

2.2 乳腺癌組織中QKI-7表達與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

結(jié)果顯示，腫瘤組織中QKI-7表達與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及孕激素受體相關(guān)（P均＜0.05），QKI-7陽性率越低，腫瘤直徑越大，腫瘤越趨于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越高；而與患者年齡、組織學(xué)類型、雌激素受體和HER2受體情況等無明顯相關(guān)性（P均＞0.05）。見表1。

2.3 乳腺癌組織中QKI-7的表達與患者預(yù)后的關(guān)系

將142例乳腺癌患者按QKI-7表達分為陰、陽性兩組，Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，QKI-7陽性患者累積生存率（87.80%）明顯高于QKI-7陰性患者（61.39%，Log-Rank檢驗，P=0.001 8）。見圖2。

圖1 乳腺癌組織和癌旁組織中QKI-7、P53和K i-67的表達（免疫組化染色×200）

表1 乳腺癌組織中QKI-7表達與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 n（%）

2.4 乳腺癌組織中QKI-7表達與P53及Ki-67表達的相關(guān)性

相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中QKI-7表達與P53表達呈正相關(guān)（r=0.579，P＜0.05），而與Ki-67表達呈負相關(guān)（r=-0.329，P＜0.05）。見表2。

圖2 不同QKI-7表達患者的Kaplan-Meier生存曲線

表2 Spearman檢驗分析QKI-7與P53及Ki-67表達的相關(guān)性

3 討論

以往有研究顯示QKI在多種實體惡性腫瘤中表達下調(diào)，其通過抑制腫瘤細胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑癌基因的作用［8，13］。本實驗結(jié)果顯示，QKI-7表達在乳腺癌組織中顯著下調(diào)，且隨腫瘤直徑增大、TNM分期升高而表達降低；此外，QKI-7在轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中較無轉(zhuǎn)移乳腺癌組織表達更低，由此表明，QKI-7低表達在乳腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的過程中可能發(fā)揮負面作用。孕激素受體是配體激活的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與配體結(jié)合后移位至胞核同DNA結(jié)合，促進乳腺上皮細胞增殖和分化［14］。QKI-7與孕激素受體呈負相關(guān)，推測QKI-7異常低表達時孕激素受體促進乳腺上皮細胞過度增殖。以往研究報道，胃癌中QKI低表達與患者不良預(yù)后有關(guān)［9］，結(jié)直腸癌中QKI異常低表達促進患者術(shù)后的復(fù)發(fā)，同時也是患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素［6］。本實驗生存分析發(fā)現(xiàn)，QKI-7陽性表達患者總生存率顯著高于QKI-7陰性表達者，說明QKI-7可以作為乳腺癌患者的不良預(yù)后標志物。

Ki-67是衡量細胞增殖活性的生物學(xué)標志物，Ki-67高表達的乳腺癌患者預(yù)后較差［15］。P53是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，同時也是腫瘤中最常發(fā)生突變的基因，在約50%的惡性腫瘤中發(fā)生突變［16］。本實驗結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，P53在乳腺癌組織中的表達水平顯著降低，可能在乳腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮負面作用；而Ki-67在乳腺癌中的表達顯著升高，其可能促進乳腺癌的發(fā)生。本實驗通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中QKI-7陽性表達與細胞增殖指標Ki-67陽性表達呈弱負相關(guān)，而與P53陽性表達呈中等正相關(guān)，提示QKI-7更可能與P53共同參與乳腺癌的進展，兩者在乳腺癌發(fā)展過程中可能起協(xié)同作用，但具體作用機制還有待進一步研究證實。

綜上所述，QKI-7在乳腺癌組織中低表達，且其可能與腫瘤增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，提示QKI-7參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展；生存分析結(jié)果表明，QKI-7低表達與患者的不良預(yù)后有關(guān)，由此表明，QKI-7可作為乳腺癌患者潛在的預(yù)后標志物。今后需要在體外細胞層面和體內(nèi)動物實驗中進一步驗證QKI-7與乳腺癌惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系，探討QKI-7參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機制。