宋格，趙耀，陸薇，王勝軍

（江蘇大學醫(yī)學院檢驗醫(yī)學研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

髓源抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是一群骨髓來源的、未成熟的異質性細胞。在正常生理條件下，骨髓中的未成熟髓樣細胞（immaturemyeloid cells，IMC）分化為成熟的粒細胞、樹突狀細胞或巨噬細胞。然而，在炎癥、創(chuàng)傷、腫瘤等病理條件下，IMC分化為成熟髓系細胞受到阻礙，停留于不同分化階段的IMC在體內大量聚集。隨后，在腫瘤細胞或炎性細胞分泌的細胞因子的誘導下，IMC分化為具有免疫抑制活性的MDSCs［1］。MDSCs在腫瘤免疫應答中起負向調控作用，有利于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［2］。已有研究表明，荷瘤小鼠腫瘤來源MDSCs比脾臟來源MDSCs分化成熟度更低、免疫抑制功能更強［3］。

三基序蛋白 25（tripartite motif containing 25，TRIM25）是TRIM家族的成員，具有E3泛素連接酶的功能。作為E3泛素連接酶，TRIM25可催化多種靶蛋白PTEN、p53、RIG-I等發(fā)生多聚泛素化修飾，激活一系列信號通路進而調控生物功能［4-6］。它通過泛素化或類泛素化調控細胞活動，在多種癌癥中發(fā)揮癌基因的作用［7-9］。研究報道TRIM25異常高表達于肺癌、結腸癌、胃癌和乳腺癌等多種癌癥［10-13］。TRIM25對免疫系統(tǒng)及免疫細胞都有著重要的調控作用［14］，但 TRIM25是否參與調控 MDSCs，目前尚未有相關文獻報道。

PTEN基因編碼的蛋白具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶雙特異磷酸酶活性，是第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因［15］。PTEN基因缺陷在人類多種腫瘤中廣泛存在。PTEN通過抑制PI3K/AKT和STAT3信號通路調控MDSCs的免疫抑制功能［16-18］。鑒于E3泛素連接酶TRIM25能夠催化PTEN的泛素化修飾，且PTEN在調節(jié)MDSCs的擴增、活化和功能中發(fā)揮重要作用，本研究中我們聯合檢測TRIM25和PTEN在腫瘤來源MDSCs中的表達情況，有助于探討MDSCs的調節(jié)機制，尋找腫瘤免疫治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料

實驗動物和細胞株：小鼠CT26結腸癌細胞株購自上海生命科學研究院細胞庫。雌性、6～8周齡、體重（20±2）g的SPF級BALB/C小鼠購自江蘇大學實驗動物中心（合格證編號：NO.201803506）。

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（美國 Gibco公司）；胰酶、Ⅰ型膠原酶、DNA酶、透明質酸酶（Sigma公司）；小鼠MDSCs分離試劑盒（Miltenyi Biotec公司）；生物素標記的抗小鼠/人CD11b抗體（Biolegend公司）；PE/Cy5標記的大鼠抗小鼠/人CD11b單克隆抗體（BioLegend公司）；PE標記的大鼠抗小鼠Gr1單克隆抗體（BD Pharmingen公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒（Takara公司）；DL500 DNA分子量標準（Takara公司）。

1.2 構建小鼠CT26結腸癌移植瘤模型

用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠CT26腫瘤細胞，放置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，細胞呈貼壁生長。待腫瘤細胞生長至對數期，用胰酶消化計數后備用。接種時，將小鼠置于超凈臺中，用酒精棉球消毒小鼠背部右側皮膚，每只小鼠皮下注射約1×106個腫瘤細胞/200μL PBS。待小鼠注射部位觸摸到質地較硬、可移動的黃豆大小的皮下結節(jié)時，即為移植瘤模型構建成功。

1.3 小鼠脾細胞懸液、腫瘤組織細胞懸液的制備

脾細胞懸液的制備：脫頸處死野生型小鼠，無菌取出小鼠脾臟，置篩網研磨，將細胞懸液移至離心管；4℃、500×g離心5 min后棄上清，加5 mL ACK裂解紅細胞，5 min后加5 mL PBE緩沖液終止裂解，再次4℃、500×g離心5 min，棄去上清，留沉淀加PBE緩沖液重懸即可獲得脾細胞懸液。

腫瘤組織細胞懸液的制備：接種腫瘤細胞后第28天處死荷瘤小鼠，眼球放血，脫頸處死。無菌剝離荷瘤小鼠的腫瘤組織，將腫瘤組織剪碎后放入50 mL Corning管，用適量的膠原酶消化（每0.25 g腫瘤組織加10 ml膠原酶），37℃水浴箱中消化1.5～2 h，每隔5 min顛倒混勻Corning管；消化結束用篩網過濾，收集濾液；4℃、500×g離心5 min后棄上清液，PBE緩沖液重懸細胞沉淀即獲得腫瘤組織細胞懸液。

1.4 小鼠脾臟來源MDSCs的分離純化

磁珠分選脾臟MDSCs：用300μL PBE緩沖液重懸脾細胞沉淀，加30μL FcR Blocking封閉液，冰上孵育 10 min；加入抗 CD11b Biotion（10μL/108細胞），冰上孵育30 min，10 min混勻一次；加入10mL PBE洗滌，4℃、500×g離心5 min后棄上清液，用300μL PBE重懸細胞沉淀，加 anti-Biotion Microbeads（15μL/108細胞），彈勻后冰上孵育30 min，每隔10 min彈勻一次；加10 mL PBE洗滌，再次離心棄上清，用500μL PBE重懸細胞沉淀。在磁性分離架上安裝好LS分離柱，用3 mL PBE潤柱后，再向LS分離柱中加入500μL細胞懸液，然后每次用3 mL PBE洗滌分離柱，共洗3次。待懸液滴盡后，取下LS分離柱置于無菌的10 mL離心管上，向柱中加入5 mL PBE，快速推動柱推使細胞流入離心管中，重復操作1次，即可獲得10 mL MDSCs細胞懸液。

1.5 流式細胞術分選腫瘤組織來源MDSCs

取制備好的小鼠腫瘤組織細胞懸液，計數，在EP管中用PBS重懸，按照0.25μg/106細胞分別加入 anti-Gr1-PE和anti-CD11b-PE/Cy5，置于4℃冰箱避光孵育30min；加1mL PBS終止染色，4℃、500×g離心5 min后棄上清，用含1%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，流式細胞儀分選獲得CD11b+Gr1+MDSCs。

1.6 RNA提取及反轉錄

將保存于-80℃冰箱中Trizol裂解的樣本取出，放置冰上融化；加入200μL三氯甲烷/1 mL Trizol，劇烈震蕩20 s，室溫靜置10 min；4℃、12 000×g離心15 min；從離心機平穩(wěn)地取出樣本，輕柔地吸取300～400μL上層水相于新的EP管中；加入500μL異丙醇，混勻，室溫靜置15 min；4℃、12 000×g離心10 min；管底可見白色沉淀，小心棄去上清，加入1 mL用DEPC水配成的75%乙醇洗滌；4℃、7 800×g離心5 min；棄上清液，置室溫，待RNA沉淀吹至半透明狀，加入10μL DEPC水溶解。核酸檢測儀測定RNA純度和濃度，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 實時熒光定量PCR檢測TRIM25和PTEN的相對表達量

小鼠TRIM25、PTEN及β-肌動蛋白引物由上海生工公司合成。TRIM25上游引物：5′-GAGGATGGAGTGCCATTGTT-3′，下游引物：5′-GGCTGACCTCAACCCTGTAA-3′，預計擴增片段為127 bp。PTEN上游引物：5′-AGGCACAAGAGGCCCTAGAT-3′，下游引物：5′-CTGACTGGGAATTGTGACTCC-3′，預計擴增片段為74 bp。

β-肌動蛋白上游引物：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游引物：5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′，預計擴增片段為349 bp。

實時熒光定量PCR擴增體系為：2×SYBR Premix ExTaq5μL；ddH2O 3.4μL；正向引物、反向引物各0.3μL；cDNA 1μL，總體系為10μL。實時熒光定量PCR反應條件：預變性95℃10 min；變性95℃ 15s；退火60℃ 30 s；延伸72℃ 30 s；進行35個循環(huán)擴增，72℃ 7 min充分延伸。TRIM25和PTEN的相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.8 瓊脂糖凝膠電泳

用3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物，將4.5μL樣本與0.5μL 10×上樣緩沖液的混合液加至加樣孔中，另一加樣孔中加入5μL DL500 DNA標準參照物。電壓110V電泳40 min左右，將凝膠放入EB染液染色10 min，清水沖洗10 min，曝光成像拍照。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行制圖，SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數據采用均數±標準差表示，運用獨立樣本t檢驗進行兩組之間的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠來源MDSCs純度的鑒定

磁珠分選野生型小鼠脾臟來源MDSCs，流式細胞術分選荷瘤小鼠腫瘤組織來源MDSCs，采用流式細胞儀鑒定MDSCs的純度。野生型小鼠脾臟來源MDSCs和荷瘤小鼠腫瘤組織來源MDSCs的純度均達90%以上。見圖1。

圖1 流式細胞術鑒定MDSCs純度

2.2 TRIM25、PTEN基因定量PCR擴增產物的鑒定

TRIM25、PTEN的實時熒光定量PCR擴增曲線呈典型 S型，CT值（cycle threshold，CT）在18～28之間，說明模板cDNA濃度合適；實時熒光定量PCR熔解曲線呈單峰，表明兩基因的引物特異性好；同時，瓊脂糖凝膠電泳顯示TRIM25、PTEN擴增產物的片段均為單一的特異性條帶，且擴增片段大小符合預期。說明MDSCs中存在 TRIM25、PTEN的表達。見圖2。

2.3 TRIM25在荷瘤小鼠腫瘤組織來源MDSCs中高表達

qRT-PCR檢測結果顯示，與野生型小鼠脾臟MDSCs相比，TRIM25在荷瘤小鼠腫瘤來源MDSCs中的表達水平顯著升高（t=4.566，P＜0.001），表明TRIM25在荷瘤小鼠腫瘤組織來源MDSCs中高表達。見圖3。

圖2 TRIM 25、PTEN基因PCR擴增產物的鑒定分析

圖3 TRIM 25在荷瘤小鼠腫瘤組織來源MDSCs中高表達

2.4 PTEN在荷瘤小鼠腫瘤組織來源MDSCs中表達水平下降

qRT-PCR檢測PTEN的表達水平。結果表明，與野生型小鼠脾臟來源MDSCs相比，荷瘤小鼠腫瘤組織來源MDSCs中PTEN的表達水平明顯下降（t=8.881，P＜0.001），表明PTEN在荷瘤小鼠腫瘤組織來源MDSCs中表達水平下調。見圖4。

圖4 PTEN在荷瘤小鼠腫瘤組織來源MDSCs中表達下調

3 討論

近年來，MDSCs已成為腫瘤微環(huán)境中抑制免疫應答的主要細胞。MDSCs是一種由大量未成熟的骨髓前體細胞組成的異質性群體，在病理狀態(tài)下被激活，并顯示出強大的免疫抑制活性［19］。MDSCs能夠抑制效應性T細胞和NK細胞的抗腫瘤免疫應答，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。正常小鼠的脾臟中僅有2%～4%CD11b+Gr1+細胞，而荷瘤小鼠脾臟中MDSCs的比例可達20%～40%，并在腫瘤局部檢測到MDSCs的大量聚集［20］。有文獻報道，與小鼠脾臟來源MDSCs相比，腫瘤局部來源MDSCs發(fā)揮更強的免疫抑制功能［21］。腫瘤局部MDSCs的產生和功能的調節(jié)是一個復雜的過程，目前已發(fā)現多種信號通路參與MDSCs的調控，如 STAT家族、C/EBP、NF-κB和PTEN/PI3K/AKT等通路，但具體的分子機制尚不十分清楚［22］。因此，我們想探究MDSCs的調控機制，為靶向MDSCs的腫瘤免疫治療提供理論基礎。

PTEN是繼p53之后發(fā)現的一個極其重要的抑癌基因。PTEN的突變或缺失與肺癌、結直腸癌、乳腺癌和前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關。MDSCs是腫瘤微環(huán)境中的主要抑制性細胞，PTEN參與調控MDSCs的擴增、活化和功能。大量的研究表明，腫瘤微環(huán)境中多種miRNA通過靶向抑制PTEN，活化 PI3K/AKT/mTOR或STAT3信號通路，促進MDSCs的擴增和免疫抑制功能［16-18］。Garcia等［23］發(fā)現前列腺上皮細胞PTEN的缺失會誘導腫瘤微環(huán)境中MDSCs的擴增和活化，從而促進前列腺癌的進展。我們的實驗結果顯示PTEN在腫瘤MDSCs中表達下調，這與以上的研究報道相一致。但PTEN對MDSCs調控的具體機制仍需繼續(xù)探討。

最近的研究發(fā)現E3泛素連接酶參與調控MDSCs的擴增、活化或功能。Tarcic等［24］指出E3泛素連接酶RNF20缺陷小鼠體內的MDSCs招募和激活增強，且這群MDSCs有很強的免疫抑制活性，抑制RNF20可能會促進慢性炎癥的發(fā)生和隨后腫瘤的進展。TRIM25作為一個重要的E3泛素連接酶，與腫瘤關系密切，在多種腫瘤組織中高表達。TRIM25對免疫細胞也有調控作用。我們的研究發(fā)現腫瘤組織來源MDSCs中TRIM25高表達，提示TRIM25可能正向調控 MDSCs的擴增、活化或功能。由于TRIM25、PTEN主要在蛋白水平發(fā)揮作用，接下來我們會進一步檢測兩者在MDSCs中的蛋白表達情況。此外，有研究證實TRIM25通過促進PTEN的K63位多聚泛素化，抑制其磷酸酶活性，促進了非小細胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展［25］。那在腫瘤局部 MDSCs中，TRIM25是否通過介導PTEN泛素化，從而調控MDSCs的擴增、活化或功能，最終影響抗腫瘤免疫應答？這一問題我們將在之后的工作中繼續(xù)研究和探討。