莊曉蘋 邵玲燕 林瓊瓊

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及雌激素等藥物的廣泛使用，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。研究表明，酪氨酸激酶受體（RON）異常表達導(dǎo)致自身磷酸化，激活下游通路，而下游通路RON/磷酯酰肌醇3-激酶（PI3K）是蛋白質(zhì)合成的主要信號調(diào)節(jié)通路，該通路激活后可以產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，從而促進細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[2]。目前國內(nèi)尚無RON/PI3K信號通路在子宮內(nèi)膜癌中表達的相關(guān)報道。本研究通過檢測RON/PI3K信號通路在子宮內(nèi)膜癌中的表達，為設(shè)計新型靶向藥物對該病患者進行精準治療提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2010年1月至2013年1月在溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的160例患者的子宮內(nèi)膜組織，其中子宮內(nèi)膜癌80例（子宮內(nèi)膜癌組），不典型增生80例（不典型增生組）；并收集同期20例因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)患者的正常子宮內(nèi)膜組織（正常組）。本研究經(jīng)溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人 RON（ab85063）、PI3K（ab32089）、磷酸化 PI3K（pPI3K）（ab182651）抗體均購自美國 Abcam公司，RT-PCR引物由大連TAKARA公司合成，ECL化學(xué)發(fā)光底物購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 子宮內(nèi)膜組織RON、PI3K和pPI3K蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度。蛋白上樣量50μg，12%SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST沖洗15min×3次。加入兔抗人RON（1:2 500稀釋）、PI3K（1∶5 000稀釋）、pPI3K（1∶5 000 稀釋）抗體，室溫孵育1.5h，4℃冰箱過夜。TBST 沖洗15min×3次，加入二抗（1:5 000），室溫孵育1.5h，TBST沖洗10min×3次。加入ECL化學(xué)液，成像儀上進行曝光獲得凝膠圖像。應(yīng)用Image J軟件對目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值進行分析，計算出目的蛋白的相對表達水平（目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比）。

1.2.3 子宮內(nèi)膜組織RON和PI3K mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。嚴格按照Trizol RNA試劑盒說明提取總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以同一cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性 30s；95℃ 5min，60℃ 30min，72℃ 1min，40個循環(huán)；最后72℃延伸7min，至反應(yīng)結(jié)束。引物序列：RON 上游引物：5′-AAGGATGTGCTGATTCCCCA-3′，下游引物：5′-TACCAATGAGAGCCAGCACA-3′；PI3K 上游引物：5′-CCTATTGTCGTGCATGTGGG-3′，下游引物：5′-AATCTGGTCGCCTCATTTGC-3′；GAPDH 上游引物：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，下游引物：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。以 GAPDH作為內(nèi)參，RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后得出目的基因及內(nèi)參基因的Ct值，采用 2-ΔΔCt法進行相對定量，每樣本重復(fù)3次，最后取平均值。

1.3 子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后隨訪 采用電話及定期復(fù)查的方式隨訪，隨訪截止時間為2018年12月30日，以死亡或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移為隨訪終點。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組子宮內(nèi)膜組織RON、PI3K和pPI3K蛋白表達水平比較 與正常組比較，子宮內(nèi)膜癌組和不典型增生組RON和pPI3K蛋白表達水平均上升，PI3K蛋白表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與不典型增生組比較，子宮內(nèi)膜癌組RON和pPI3K蛋白表達水平均上升，PI3K蛋白表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1和圖1。

表1 3組子宮內(nèi)膜組織RON、pPI3K和PI3K蛋白表達水平比較

圖1 3組子宮內(nèi)膜組織RON、PI3K和pPI3K蛋白表達的電泳圖

2.2 3組子宮內(nèi)膜組織RON和PI3K mRNA表達水平比較 與正常組比較，子宮內(nèi)膜癌組和不典型增生組RON和PI3K mRNA表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與不典型增生組比較，子宮內(nèi)膜癌組RON和PI3K mRNA表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表 2。

表2 3組子宮內(nèi)膜組織RON和PI3K mRNA表達水平比較

2.3 子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后隨訪情況 子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后隨訪時間為1～60個月，中位生存期為44個月。死亡15例，復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移3例，無瘤生存62例。

3 討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個動態(tài)生物學(xué)過程，涉及多種分子的異常表達和相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控。RON屬于人類受體酪氨酸激酶家族（RTK）中的Met原癌基因亞家族，其生物學(xué)效應(yīng)主要是通過與巨噬細胞刺激蛋白（MSP）結(jié)合而活化，介導(dǎo)多種細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、表型轉(zhuǎn)化、侵襲遷移等多個方面起到重要作用[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RON蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織、不典型增生子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中表達水平呈遞增趨勢；Cox單因素回歸分析顯示，子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后與腫瘤組織學(xué)分級、c-Met/RON異常表達、c-Met/RON共同高表達有關(guān)；Cox多因素回歸分析顯示，腫瘤組織學(xué)分級高（低分化）、c-Met/RON共同高表達是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的獨立危險因素[4]。此外，本課題組在實驗中還發(fā)現(xiàn)，RON及其下游PI3K信號通路的異常激活[4]。這個結(jié)果與Bieniasz等[5]提出在缺氧狀態(tài)下RON可通過激活PI3K介導(dǎo)細胞增殖、存活、遷移參與腫瘤的發(fā)生的研究結(jié)論一致。

PI3K存在于細胞質(zhì)中，是磷脂激酶家族中的一個重要成員[6]，具有脂類激酶活性與蛋白激酶活性。PI3K主要從酪氨酸激酶連接受體傳遞信號，當RON與特異性配體MSP結(jié)合后，通過RON受體分子二聚化而產(chǎn)生自身激酶域的磷酸化，與p85α上的SH2區(qū)結(jié)合，引起PI3KⅠA二聚體構(gòu)象改變而激活PI3K[7]。PI3K激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3通過與Ak的N端PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將蛋白激酶B（Akt）轉(zhuǎn)位于細胞膜上。同時，在3-磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）協(xié)助下，催化 Akt蛋白的蘇氨酸磷酸化位點（Thr308）磷酸化，并通過3-磷酸肌醇依賴性激酶2（PDK2）催化絲氨酸磷酸化位點（Ser473）磷酸化，從而最大限度激活A(yù)kt[8]。過度活化的Akt激活其下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，可以引起腫瘤細胞的快速增殖、蛋白分泌增加、細胞周期加快、G1期時程縮短，從而促進腫瘤的迅速發(fā)生、發(fā)展[9-11]。因此，RON/PI3K信號通路是蛋白質(zhì)合成的主要信號調(diào)節(jié)通路，參與細胞增殖、分化、遷移等的調(diào)節(jié)。目前已有研究發(fā)現(xiàn)RON及其下游信號通路的異常激活（如PLCγ/DAG/PKC通路、PI3K/Akt通路、Ras/Raf/MAPK通路等）與膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、膽管癌、前列腺癌等[12-16]多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有可能成為腫瘤治療的一個潛在的重要靶點，因而備受關(guān)注。RT-PCR法證實，與不典型增生組和正常組比較，子宮內(nèi)膜癌組RON和PI3K mRNA表達水平均下降，表明RON/PI3K與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。

RON/PI3K牽涉各種腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移，包括黏附、侵襲、遷移、增殖、抑制凋亡。Ling等[2]研究RONΔ165E2變異體通過張力蛋白同源蛋白（PTEN）磷酸化激活PI3K/AKT通路，促使腫瘤的發(fā)生，在67例人類結(jié)直腸癌樣本中，約58%的樣本存在該變異體高表達，并且與腫瘤浸潤深度也呈正相關(guān)。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)短小RON能通過PI3K信號通路來自發(fā)主動地引起乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。PI3K通常以無活性的方式存在細胞質(zhì)中，受到一些基因刺激后pPI3K磷酸化激活，進一步激活其下游因子如B細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）家族、p53、叉頭轉(zhuǎn)錄因子等，從而促進腫瘤細胞的調(diào)亡、增殖、分化及遷移。本研究Western blot法檢測結(jié)果顯示RON和pPI3K蛋白在子宮內(nèi)膜癌組表達最高，而在不典型增生組表達量較少，正常組最弱，提示RON和pPI3K表達量隨著子宮內(nèi)膜癌的進展是逐漸增加的，其腫瘤惡性程度越高，pPI3K磷酸化越明顯，進一步證實RON通過刺激pPI3K磷酸化，激活PI3K信號通路途徑促進子宮內(nèi)膜癌的浸潤、轉(zhuǎn)移。

綜合文獻證據(jù)和本課題研究結(jié)果，可以認為RON/PI3K與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，兩者有可能作為腫瘤標志物用于子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療，這為筆者了解RON調(diào)控子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移的機制拓展了思路，同時也為子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移機制的研究和相關(guān)靶向新藥物的研發(fā)提供新的啟示。