莫建梅 劉鶯燕 李慶國

摘要：利用目標起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism，簡稱SCoT）和巢式（Nested）PCR 2種分子標記技術(shù)建立“龍頭鳳尾”鐵皮石斛DNA分子鑒別的方法，并研究其復方制劑的降血糖作用。用SCoT標記設(shè)計1對引物SC3，開發(fā)特異性檢測“龍頭鳳尾”鐵皮石斛的Nested PCR方法，建立分子鑒別質(zhì)量標準;利用鑒別后的石斛制備復方膠囊，對鏈脲佐菌素加高脂飼料復制的胰島素抵抗/脂代謝紊亂型糖尿病大鼠進行降血糖藥效學研究，觀察其對模型大鼠空腹血糖、糖耐量、血清膽固醇、胰島素等的影響。結(jié)果顯示，用設(shè)計的特異性引物SC3對其進行SCoT-Nested PCR擴增后，僅在睿紳2號中擴增出1條清晰的目標條帶，而在其他鐵皮石斛品種中均沒有出現(xiàn)目標條帶，從而實現(xiàn)特異性鑒別。其復方石斛膠囊降血糖作用的規(guī)律為：與正常對照組比較，造模組大鼠血糖水平、血糖曲線下面積、總膽固醇含量顯著增加（P<0.01），血清胰島素含量顯著減少（P<0.01）;與造模組比較，復方膠囊高、中劑量組大鼠血糖水平、血糖曲線下面積、總膽固醇含量顯著減少（P<0.05），大鼠體質(zhì)量、血清胰島素含量顯著增加（P<0.05）。說明SCoT-Nested PCR分子標記可以利用1對引物SC3對“龍頭鳳尾”鐵皮石斛睿紳2號進行特異性鑒別;其制備的復方膠囊高、中劑量組對鏈脲佐菌素加高脂飼料致胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂型模型大鼠具有一定的降血糖作用，增加胰島素分泌，降低血清膽固醇含量。能夠提高該品種石斛的質(zhì)量標準，其制劑產(chǎn)品具有較好的降血糖作用。

關(guān)鍵詞：“龍頭鳳尾”鐵皮石斛;SCoT標記;Nested PCR;降血糖;基因鑒別

中圖分類號： S567.23+9.01;R285 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0182-04

鐵皮石斛為蘭科石斛屬多年草本附生植物，富含多糖、生物堿等成分[1]，能增強胰島素活性和降低糖尿病患者血糖作用[2]。傳統(tǒng)的石斛鑒定是基于形態(tài)學、解剖學和化學分析的傳統(tǒng)方法，以形態(tài)、感官為主，如莖粗、質(zhì)量、嚼之黏牙、味甘、無渣等為指標[3-4]，但這些傳統(tǒng)方法并不能完全反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量，很難從幼苗或干莖中鑒定石斛屬物種，也不利于產(chǎn)業(yè)管理的規(guī)范化。近年來，隨著DNA分子標記技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用這些技術(shù)鑒定石斛品種得到了迅速的發(fā)展[5]。其中，以目標起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism，SCoT）標記技術(shù)[6]在石斛鑒定、種質(zhì)源評估以及遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析上得到了較為廣泛的應(yīng)用。巢式PCR（nested PCR）分子標記因其擴增非常具有特異性而被廣泛應(yīng)用[7-8]，其結(jié)果一般表現(xiàn)為擴增片段的有無，具有簡單易用、重復性好、擴增結(jié)果無須測序等優(yōu)點。SCoT分子標記和巢式PCR分子標記二者的結(jié)合將為鐵皮石斛的鑒定提供新的檢測手段。

本研究所用的鐵皮石斛是由東莞市睿紳生物技術(shù)有限公司以“三步法”栽培的“龍頭鳳尾”形，是優(yōu)質(zhì)的石斛新品種，其多糖含量高達45.34%，比普通市售石斛的多糖含量高80%左右[《中華人民共和國藥典（2015年版）》規(guī)定多糖含量≥25%]，由于其多糖含量顯著高于市售產(chǎn)品，對其進行基因鑒別和產(chǎn)品開發(fā)非常有必要。本研究基于DNA分子標記技術(shù)，采用SCoT分子標記和巢式PCR分子標記結(jié)合技術(shù)進行藥材鑒別研究，建立高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)“龍頭鳳尾”鐵皮石斛的質(zhì)量標準。在此基礎(chǔ)上，以高糖鐵皮石斛睿紳2號為君藥，配伍五味子、黃芪、葛根等中藥，開發(fā)復方膠囊產(chǎn)品，用鏈脲佐菌素加高脂飼料復制的胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂型糖尿病大鼠進行降血糖藥效學研究，觀察本復方對模型大鼠的血糖含量、糖耐量、血清胰島素含量、膽固醇含量等的影響，以明確本復方是否具有降低血糖的藥效學作用，為開發(fā)鐵皮石斛新型保健品提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 5020型96孔梯度PCR儀、超微量紫外分光光度計[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];2500型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）;C.B.S水平電泳槽[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司];血糖儀、試紙（瑞士羅氏制藥公司）;5427型冷凍離心機（艾本德中國有限公司）;1510型酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];EL204-IC型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.1.2 試驗藥品 基因組DNA提取試劑盒（批號：DP305，北京天根生化科技有限公司）;具有核酸外切酶（exonuclease）活性的耐熱性DNA聚合酶（Ex Taq酶）[批號：RR01AM，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司];具有核酸外切酶（exonuclease）活性的耐熱性DNA聚合酶預(yù)混合液（Ex Taq PCR Master Mix）[批號：RR003A，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司];SYBR Safe脫氧核糖核苷酸（DNA）凝膠染料[批號：S33102，賽默飛世爾科技（中國）有限公司];引物均由華大基因科技有限公司合成;鏈脲佐菌素（批號：S0130，美國Sigma公司）;鹽酸二甲雙胍（批號：M107827，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;葡萄糖（天津市致遠化學試劑有限公司）;大鼠胰島素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）;總膽固醇測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）;高脂高膽固醇飼料（廣東省醫(yī)學實驗動物中心）。

1.1.3 植物樣本 4種石斛樣本分別為鐵皮石斛睿紳2號、睿紳1號、睿紳3號、睿紳4號，記為RS-2、RS-1、RS-3、RS-4。4種石斛樣本均由東莞市睿紳生物技術(shù)有限公司栽培與提供。

1.1.4 石斛復方制劑制備處方及制備方法 稱取葛根、五味子、黃芪藥材（質(zhì)量比為1 ∶ 2 ∶ 2），加入10倍量溶劑（30%乙醇），提取3次，每次1 h，合并濾液，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮，真空干燥后，加入鐵皮石斛睿紳2號超微粉適量混勻，濕法制粒，70%乙醇潤濕，將制得顆粒于50～60 ℃下干燥2 h左右，將干燥后的顆粒過20目篩，整粒，直接填充膠囊即可。

1.1.5 試驗動物 健康SPF（無特定病原體）級，斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague Dawley，簡稱SD）大鼠，雄性80只，體質(zhì)量為（160±20）g，由廣州中醫(yī)藥大學科學實驗動物中心提供[動物使用合格證號：SCXK（粵）2013-0034];試驗地點為廣州中醫(yī)藥大學科學實驗動物中心，試驗時間為2017年11月至2018年2月[廣東省動物實驗證明許可證號：SCXK（粵）2013-0085]。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 采用植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）提取總DNA，所得DNA用超微量紫外可見分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量及完整性，根據(jù)檢測結(jié)果將DNA濃度稀釋至20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SCoT-PCR標記的擴增 對4種石斛樣本使用通用SCoT引物S8（5′-CAACAATGGCTACCACGT-3′）進行SCoT-PCR擴增。SCoT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：1 μL 20 ng/mL DNA模板，Mg2+濃度為2.0 mmol/L、dNTPs濃度為 0.2 mmol/L、0.2 μL 5 U/mL Ex Taq DNA聚合酶和引物 0.5 μmol/L，不足用ddH2O（去離子水）補足;擴增程序參考Collard等的原始擴增程序[8]略作修改：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸 2 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.2.3 SCoT特異片段的回收、克隆、測序及引物設(shè)計 擴增獲得的鐵皮石斛睿紳2號SCoT特異性DNA片段進行回收、純化及克隆并送往北京六合華大基因科技有限公司進行序列測定。使用在線程序BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分析測序的DNA序列的同源性，并且使用在線Primer 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3/）對特異性SCoT片段的核苷酸序列設(shè)計1對特異性引物SC3：上游引物的序列為5′-CTCGCCATATCGTCGAGCA-3′;下游引物的序列為5′-ACGTTCTGTTATGGGGTCCT-3′。

1.2.4 SCoT-Nested PCR標記檢測體系的建立 以4種石斛樣本DNA為模板，進行SCoT-Nested PCR標記特異性個體驗證，將第1次SCoT-PCR的擴增產(chǎn)物作為第2次擴增的DNA模板來進行巢式PCR擴增。20 μL巢式PCR反應(yīng)體系為10 μL Ex Taq PCR Master Mix， 2 μL 2.5 mmol/L引物，1 μL 模板（稀釋1 000倍），不足用ddH2O（去離子水）補足。PCR儀擴增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性50 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán);72 ℃延伸8 min。擴增反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL擴增產(chǎn)物，向樣品中加入2 μL 6×上樣緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠（含核酸染料）中電泳分離，最后在凝膠成像系統(tǒng)觀察和記錄。

1.2.5 模型的復制 雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)體質(zhì)量隨機分成6組（正常組與5組造模組），正常組繼續(xù)喂食普通飼料，造模組更換高脂飼料，喂飼3周后禁食至少12 h（不禁水），正常組腹腔注射生理鹽水28 mg/kg，造模組給予鏈脲佐菌素（STZ）28 mg/kg[用0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉溶液（pH值為4.0）稀釋成1%溶液]腹腔注射。造模組繼續(xù)給予高脂飼料喂飼3～5 d，尾靜脈采血測定空腹血糖（禁食 4 h），15～20 min后經(jīng)口給予葡萄糖2.5 g/kg，測定給葡萄糖后各組 0.5、2.0 h的血糖值，0.5 h血糖值≥10 mmol/L納入胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型。

1.2.6 樣品及處理 試驗分為6個組，即正常對照組（等容生理鹽水），模型對照組（等容生理鹽水），二甲雙胍組（125 mg/kg）、鐵皮石斛復方膠囊高、中、低（1.0、0.5、0.25 g/kg）劑量組，灌胃給藥，給藥量均為1 mL/100 g，連續(xù)28 d，自由進食、飲水，每周測定大鼠體質(zhì)量。

1.2.7 指標檢測

1.2.7.1 空腹血糖值的測定 試驗4周后，大鼠禁食不禁水4 h，用血糖儀尾靜脈采血測定空腹血糖值。

1.2.7.2 糖耐量試驗 試驗4周后，大鼠禁食不禁水4 h，測定空腹血糖值，15～20 min后經(jīng)口給予葡萄糖2.5 g/kg，尾靜脈采血測定給予葡萄糖后0.5、2.0 h的血糖值，進行糖耐量試驗，計算血糖曲線下面積。

1.2.7.3 血清膽固醇水平和血清胰島素水平的測定 各組動物禁食不禁水4 h，腹主動脈取血，按測定試劑盒說明方法檢測血清總膽固醇水平，酶聯(lián)免疫法測定血清胰島素水平。

1.2.8 統(tǒng)計學方法 試驗數(shù)據(jù)用SPSS 20軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料以 “x±s”表示;用單因素方差進行組間組內(nèi)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT-PCR標記結(jié)果分析

對4種石斛樣本使用通用SCoT引物S8進行SCoT-PCR擴增，結(jié)果表明，在同一遷移位置上，只有睿紳2號才特有的電泳條帶，而其他3種石斛在相同位置均沒有出現(xiàn)相同的條帶（圖1）。將該PCR擴增片段回收克隆測序確定該片段長度為1 568 bp，BLAST比對發(fā)現(xiàn)，NCBI數(shù)據(jù)庫中無任何同源序列。

2.2 SCoT-Nested PCR標記引物的特異性檢測

以4種石斛樣本DNA為模板，進行睿紳2號SCoT-Nested PCR標記特異性個體驗證。結(jié)果表明，用設(shè)計的特異性引物對其進行擴增后，僅在睿紳2號中擴增出1條清晰的目標條帶，而在其他3個石斛品種中均沒有出現(xiàn)目標條帶（圖2）。因此，此引物只對睿紳2號有特異性擴增效果，從而對其進行特異性鑒別。

2.3 鐵皮石斛復方膠囊對模型大鼠體質(zhì)量的影響

給藥前，各組體質(zhì)量均無顯著性差異;給藥4周后，與正常對照組比較，造模組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P<0.01）;與造模組比較，二甲雙胍組，鐵皮石斛復方膠囊中、高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著增加（P<0.05），表明其生長狀態(tài)良好，低劑量給藥組大鼠體質(zhì)量沒有顯著性差異（表1）。

2.4 鐵皮石斛復方膠囊對模型大鼠空腹血糖值的影響

給藥前，與正常對照組比較，造模組大鼠空腹血糖值顯著升高（P<0.01）;與造模組比較，二甲雙胍組，鐵皮石斛復方膠囊中、低、高劑量組大鼠血糖無顯著性差異。給藥4周后，與正常對照組比較，造模組大鼠空腹血糖值顯著升高（P<0.01）;與造模組比較，鐵皮石斛復方膠囊中、高劑量組大鼠空腹血糖值顯著降低（P<0.05），表明鐵皮石斛復方膠囊具有明顯控制模型大鼠血糖值升高的作用，并存在一定的劑量依賴關(guān)系（表2）。

2.5 鐵皮石斛復方膠囊對模型大鼠糖耐量的影響

與正常對照組比較，造模組大鼠血糖值顯著升高，曲線下面積顯著增加（P<0.01）;與造模組比較，給藥2.0 h后鐵皮石斛復方膠囊高、中劑量組模型大鼠曲線下面積顯著減少（P<0.05）（表3）。

2.6 鐵皮石斛復方膠囊對模型大鼠血清總膽固醇和血清胰島素的影響

與正常對照組比較， 造模組大鼠總膽固醇水平顯著升高（P<0.01），造模組大鼠血清胰島素水平顯著降低（P<0.01）。與造模組比較，二甲雙胍組，鐵皮石斛復方膠囊中、高劑量組模型大鼠總膽固醇水平顯著降低（P<0.05），胰島素水平顯著升高（P<0.05）;低劑量給藥組模型大鼠總膽固醇、胰島素水平?jīng)]有顯著性差異（表4）。大鼠血清總膽固醇、血清胰島素的測定，嚴格按照試劑盒說明書進行。

3 討論與結(jié)論

本試驗中SCoT和Nested PCR的組合，顯著改善了該技術(shù)的穩(wěn)定性和可靠性。SCoT-Nested PCR分子標記表明，利用設(shè)計的特異性引物可以對睿紳2號進行特異性鑒別，此遺傳標記的使用可以大大減少育種時間、節(jié)省人力和物力，便于快速大量篩選子代，并且從分子水平上進行特異性鑒別，對于保證中藥質(zhì)量規(guī)范其生產(chǎn)全過程，促進中藥材標準化，保證該復方制劑臨床用藥有效、安全、穩(wěn)定具有重要的科學意義和應(yīng)用價值。

鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)的中藥材，兼具藥物和健康保健功效[9-12]，其制備復方制劑的研究結(jié)果表明，采用高熱量飲食并結(jié)合低劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方法復制糖尿病模型后，血糖水平顯著升高（P<0.01），分別給予高、中、低劑量（1.0、0.5、0.25 g/kg）鐵皮石斛復方膠囊后，模型大鼠空腹的血糖值和血糖曲線下面積有不同程度的降低，并存在一定的劑量依賴關(guān)系，其中高、中劑量組能顯著減少總膽固醇水平（P<0.05），增加血清胰島素含量（P<0.05），說明鐵皮石斛復方膠囊可能具有修復或者提高胰島B細胞功能，抑制糖尿病可能的發(fā)病機制[13]，在降低血糖方面具有一定的效果。

目前，鐵皮石斛活性成分的研究主要集中在多糖等類物質(zhì)上。本試驗制備的復方制劑，給藥劑量?。?.0、0.5 g/kg），降血糖作用顯著。陳愛君等以3 g/kg鐵皮石斛劑量灌胃給藥，可降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖水平[14]，但給藥劑量明顯高于本研究結(jié)果。因此，建立高質(zhì)量的鐵皮石斛藥材質(zhì)量標準并開發(fā)有效的復方制劑，是石斛產(chǎn)業(yè)日后的主要發(fā)展方向。

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