南程慧 薛曉明 伊賢貴

摘要：以MS+0.1 mg/L NAA為基本培養(yǎng)基，迎春櫻無菌初代培養(yǎng)材料于2～4 mg/L 6-BA誘導10 d后轉接于MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)為5.9～10.7;壯苗培養(yǎng)以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3+5 g/L瓊脂為宜，材料后期生長旺盛，培養(yǎng)基污染率低，材料于C1中誘導10 d后轉接于此培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為8.2，叢芽健壯;以3/4MS為基本培養(yǎng)基，NAA濃度為0.04～0.08 mg/L時，生根率為 91.5%～100.0%，不定根較多，莖葉健壯;生根苗開瓶后直接移栽于V細沙 ∶ V珍珠巖 ∶ V蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1組成的基質(zhì)穴盤中，培養(yǎng)室中生長20 d時成活率為93.8%。

關鍵詞：迎春櫻;組培;培養(yǎng)基;增殖系數(shù);生根率;快繁體系

中圖分類號： S685.120.4+3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0048-04

迎春櫻（Cerasus discoidea）屬薔薇科（Rosaceae）櫻屬（Cerasus）[1-2]，是我國野生櫻花資源中的特有種;傘形花序，著花1～3朵，花色粉紅，2—3月先葉開放，為早春優(yōu)質(zhì)的觀賞花木;主要分布于安徽南部、江西東北部、浙江大部等地的山谷林中或溪邊灌叢中海拔200～1 100 m處。

迎春櫻作為華東低海拔山區(qū)重要的春花樹種，南京、杭州、武漢、南昌、上海、無錫、長沙等地已對其進行園林利用，但多為直接的野外成樹移植，這對其野生資源的自然更新造成一定的破壞，科學合理的引種繁育體系鮮見報道[3]。野外調(diào)查結果顯示，由于受人為開發(fā)、自然繁殖衰退等因素的影響，野生迎春櫻的種群數(shù)量有逐漸減少的趨勢。為合理保護和開發(fā)利用野生迎春櫻資源，建立科學快速的無性繁育體系，在前期已獲得無菌外植體的基礎上，本研究對其組培快繁體系的建立進行了系統(tǒng)的研究，以期為迎春櫻的合理開發(fā)利用及保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在前期組培無菌外植體研究的基礎上，以0.2 g/L GA3處理過的迎春櫻種子為試驗材料[4-5]，于溫度為15 ℃、光照度1 500～2 000 lx、光暗周期16 h/8 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d左右，以具有2張真葉的無菌沙床苗為外植體材料。

1.2 試驗條件

培養(yǎng)室溫度為（23±2） ℃，光照度為1 500～2 000 lx，每天光照16 h。

1.3 試驗方法

1.3.1 叢芽誘導與增殖試驗 選用光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 d左右的迎春櫻沙床苗為外植體材料，剪去幼根，無菌水浸洗3遍，70%乙醇浸洗30 s后，無菌水浸洗3遍，再用0.2% HgCl2溶液浸洗3 min后，無菌水浸洗5～6遍，置于滅菌濾紙上吸干材料表面水分后，將每個材料剪成帶子葉和真葉的莖段接種于MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的啟動培養(yǎng)基上;培養(yǎng)室中培養(yǎng)30 d左右，選擇無菌增殖芽進行叢芽的誘導與增殖。叢芽誘導與增殖以MS為基本培養(yǎng)基，含30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂粉，附加0.5～6.0 mg/L細胞分裂素6-BA、0.05～0.40 mg/L 生長素NAA，pH值為5.8。采用梯度和交叉配比的方法進行目的培養(yǎng)基的篩選試驗，30 d時進行觀測統(tǒng)計。

1.3.2 繼代壯苗試驗 以MS為基本培養(yǎng)基[6-10]，附加 0.5 mg/L 細胞分裂素6-BA、0.05 mg/L生長素NAA、0.5～2.0 mg/L GA3、4～7 g/L瓊脂粉，pH值5.8，蔗糖30 g/L，采用梯度和交叉配比的方法進行壯苗培養(yǎng)基的篩選試驗。

1.3.3 生根培養(yǎng)試驗 分別以1/4MS、1/2MS、3/4MS、MS為基本培養(yǎng)基，附加0.2～1.0 mg/L生長素NAA，采用梯度和交叉配比的方法進行生根培養(yǎng)基的篩選試驗。

1.3.4 試管苗移栽試驗 選取生根培養(yǎng)40 d左右的健壯生根苗，分別采用開瓶煉苗5 d后移栽[11-15]和開瓶后直接移栽的方法[12]進行試管苗的移栽試驗，生根苗出瓶時須清水沖洗干凈，并用0.1%多菌靈蘸根處理;在參考前人試驗的基礎上[13]，選用高溫滅菌過的V細沙 ∶ V珍珠巖 ∶ V蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1組成的基質(zhì)作為栽培基質(zhì)，于穴盤中生長20 d后觀測統(tǒng)計試管苗移栽成活情況。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對叢芽誘導與增殖的影響

沙床苗轉接至MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA初代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 d時增殖系數(shù)為2.2，增殖芽數(shù)量少，難以滿足組培快繁的需要;在前期的預試驗中，高濃度的6-BA刺激可誘導叢芽發(fā)生，據(jù)此筆者在初代培養(yǎng)基上，通過對6-BA、NAA的濃度進行梯度和交叉配比的方法來探討外源激素對迎春櫻叢芽誘導與增殖的影響（表1）。

根據(jù)A1、B1、C1、D1、F1試驗觀測結果，在NAA濃度為 0.10 mg/L 不變的條件下，通過對6-BA的濃度進行梯度和交叉配比可知，在培養(yǎng)基中只有外源激素NAA的情況下，NAA起到促進不定根產(chǎn)生的作用，6-BA在濃度為1.0 mg/L時可促進叢芽的產(chǎn)生，隨著其濃度的逐漸提高，其作用由促進叢芽產(chǎn)生轉變?yōu)榇龠M紫紅色愈傷組織產(chǎn)生（圖1），從而抑制了叢芽的產(chǎn)生;根據(jù)E1、F1、G1、H1、I1試驗觀測結果，在 6-BA 為1.0 mg/L不變的條件下，通過對NAA的濃度進行梯度和交叉配比可知，在培養(yǎng)基中只有外源激素6-BA的情況下，6-BA則起到促進叢芽產(chǎn)生的作用，隨著NAA濃度的逐漸提高，NAA對迎春櫻的影響由A1中的促進生根轉變?yōu)榇龠M外植體基部黃綠色愈傷組織的產(chǎn)生，從而抑制了不定根及叢芽的產(chǎn)生。由此可知，6-BA對迎春櫻的影響在于促進其叢芽的產(chǎn)生，NAA則起到促進其不定根產(chǎn)生的作用，高濃度的6-BA、NAA均可促進愈傷組織的產(chǎn)生，從而抑制叢芽和不定根的產(chǎn)生。

據(jù)J1、K1、L1、M1、N1試驗觀測結果可知，在NAA濃度為0.05 mg/L不變的情況下，6-BA濃度在0.4～0.6 mg/L時叢芽生長較好，過低或過高濃度的6-BA均不利于迎春櫻外植體高生長。外植體于B1、C1、D1中刺激10、40 d時轉接至L1培養(yǎng)基中，叢芽發(fā)生明顯;刺激10 d時轉接的材料隨著 6-BA 濃度的提高，叢芽增殖系數(shù)逐漸升高，其中外植體于D1轉接至L1的增殖系數(shù)最大，達17.1，部分單株增殖系數(shù)最大可達49.5，但過高刺激產(chǎn)生的叢芽生長細弱，部分葉片卷縮、枯黃，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象;刺激40 d時轉接的材料隨著 6-BA 濃度的提高，叢芽增殖系數(shù)下降或無叢芽產(chǎn)生。由此可知，叢芽誘導與增殖試驗時，6-BA刺激濃度不易過高，時間不易過長，刺激濃度過高時，后期叢芽生長不良，以2～4 mg/L 刺激濃度為宜;刺激時間過長時，外植體轉變?yōu)橛鷤M織，后期轉接生長難以誘導叢芽，以刺激時間10 d左右、材料未形成明顯的愈傷組織為宜。

2.2 繼代壯苗

叢芽誘導與增殖試驗中6-BA刺激濃度過高容易導致叢芽過多，后期生長出現(xiàn)叢芽細弱、葉片卷縮、枯黃、玻璃化等現(xiàn)象，同時叢芽增殖多、生長快需要消耗大量水分，外植體生長一段時間后容易造成培養(yǎng)基失水開裂，出現(xiàn)材料后期生長衰弱的現(xiàn)象;赤霉素具有促進細胞分裂和莖的伸長的作用，瓊脂濃度則對培養(yǎng)基軟硬具有調(diào)節(jié)作用，為達到繼代壯苗的目的，在附加GA3的基礎上，對MS培養(yǎng)基中瓊脂濃度進行調(diào)節(jié)，以篩選出適合迎春櫻后期生長的壯苗培養(yǎng)基。每個處理36個材料，30 d后觀測統(tǒng)計材料生長情況，具體結果見表2。

由表2可知，A2、B2、C2、D2處理中，材料葉片開展，無葉片卷縮畸形及玻璃化現(xiàn)象，除B2莖高1.5～2.5 cm外，各處理高生長不明顯，處理間差別不大，均有少量的生根現(xiàn)象，B2處理材料后期生長最好。據(jù)此可知GA3起到促進迎春櫻葉片開展、減少玻璃化的現(xiàn)象，GA3濃度為1.0 mg/L時，可起到促進迎春櫻葉片開展、莖段伸長的目的。

以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3 為基本培養(yǎng)基， 對培養(yǎng)基中瓊脂濃度進行梯度交叉配比可知，培養(yǎng)基中瓊脂濃度≥5.5 g/L時，30 d觀測時均有不同程度的開裂現(xiàn)象，其中，瓊脂含量為7.0 g/L時，開裂率達73.3%，材料后期生長減弱;瓊脂濃度降低，開裂率隨之降低。瓊脂濃度≤5.0 g/L，30 d觀測時培養(yǎng)基無開裂，有不同程度的污染現(xiàn)象;瓊脂濃度≤4.0 g/L時，培養(yǎng)基呈流質(zhì)狀或液態(tài)，接種操作困難，培養(yǎng)基容易污染，后期污染率高達90.9%，材料生長畸形;瓊脂濃度為4.5～6.0 g/L時，培養(yǎng)基呈固態(tài)，接種操作容易，后期材料生長旺盛，新生真葉6～8張。由此可知，培養(yǎng)基瓊脂濃度不宜過低或過高，以30～40 d不開裂為基準，培養(yǎng)基中瓊脂濃度為5.0 g/L左右時，可起到繼代壯苗的目的。

外植體材料于C1中培養(yǎng)10 d后轉接至H2，30 d時觀測叢芽增殖系數(shù)為8.2，葉片開展，葉色黃綠，后期生長健壯（圖2），起到叢芽誘導增殖及壯苗的雙重目的。

2.3 生根培養(yǎng)

由叢芽誘導與增殖試驗結論可知，NAA具有促進外植體基部產(chǎn)生不定根的作用，依據(jù)前人的相關研究通過對MS培養(yǎng)基中大量元素和NAA濃度進行梯度和交叉配比的方法[10-13]，探討適合迎春櫻的生根培養(yǎng)基。40 d時觀測生根生長情況，具體配比觀測結果見表3、圖3。

由表3可知，對MS培養(yǎng)基中的大量元素進行梯度配比，各處理均有不同程度的生根現(xiàn)象，A3處理生根率最低，為 79.2%，40 d時根長僅0.5～2.5 cm，莖高約1 cm，生長緩慢;B3、C3、D3處理生根率均在90%以上，具不定根1～8條，不定根又具多數(shù)須根，米黃色或黃白色，B3、D3處理根長較C3短，莖高1～2 cm，葉色墨綠，生長健壯。據(jù)此可知，迎春櫻為易生根植物，MS培養(yǎng)基中不添加任何外源激素的情況下均有不同程度的生根現(xiàn)象;培養(yǎng)基中大量元素過低對迎春櫻生根及莖葉健壯生長有不利影響，過高則對其生根造成一定的抑制作用，影響不定根的伸長，以3/4MS培養(yǎng)基生根效果較好，但不定根細弱，移栽容易斷根。

以3/4MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，對NAA濃度進行梯度交叉配比可知，隨著NAA濃度的提高，不定根由細變粗，生根率也逐漸提高，培養(yǎng)基中NAA濃度達0.08 mg/L時，生根率可達100.0%;NAA濃度為0.10 mg/L時，生根率雖高，但莖葉生長較弱，40 d觀測時，莖高未生長，莖葉發(fā)黃，逐漸失去生長能力;NAA濃度≤0.02 mg/L時，不定根細弱，NAA作用不明顯。據(jù)此可知，以3/4MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，NAA濃度對迎春櫻不定根的粗細、健壯有影響，濃度過低不定根細弱，濃度過高不定根粗短，莖葉生長緩慢，NAA濃度0.04～0.08 mg/L 是迎春櫻生根培養(yǎng)基的合適濃度，生根率均在91%以上，不定根較多，莖葉健壯。

2.4 生根苗的煉苗移栽

選取F3、G3、H3培養(yǎng)基中的健壯生根苗進行煉苗移栽試驗，采用開瓶煉苗5 d后移栽于V細沙 ∶ V珍珠巖 ∶ V蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1組成的基質(zhì)穴盤中的方法，20 d時觀測生根苗成活率為 9.4%;采用開瓶后直接移栽于V細沙 ∶ V珍珠巖 ∶ V蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1組成的基質(zhì)穴盤中的方法，將穴盤置于培養(yǎng)室（培養(yǎng)溫度、光照等條件同生根培養(yǎng)一致）中培養(yǎng)20 d時觀測生根苗成活率為93.8%，新生真葉2～3張（圖4）。

據(jù)試驗觀測結果可知，開瓶煉苗5 d后培養(yǎng)基開裂，生根苗部分不定根暴露于空氣中，干燥失水，失去活力，同時上部葉片失水萎蔫，移栽后成活率低，這種方法不適于迎春櫻的煉苗移栽;迎春櫻為易生根植物，生根培養(yǎng)不定根良好，采用直接移栽于同等溫度、光照條件下煉苗移栽的方法，移栽后緩苗期短，污染率低，植株生長健壯，生根苗成活率達93.8%，該方法較前一種方法更適于迎春櫻的煉苗移栽。

3 討論與結論

在MS+0.1 mg/L NAA為基本培養(yǎng)基的條件下，6-BA具有促進迎春櫻叢芽產(chǎn)生的作用，濃度過高則促進愈傷組織的產(chǎn)生。在叢芽誘導與增殖試驗中，可采取前期高濃度6-BA刺激誘導叢芽，后期低濃度增殖生長的方法進行迎春櫻的叢芽誘導與增殖;前期刺激6-BA濃度以2～4 mg/L為宜，刺激時間10 d左右，后期轉接至MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)為5.9～10.7，起到叢芽誘導與增殖的目的，轉接至MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3+5 g/L瓊脂壯苗培養(yǎng)基上，30 d時增殖系數(shù)為8.2，起到叢芽誘導增殖及壯苗的雙重目的。隨著繼代次數(shù)的增多，外源激素在植物體內(nèi)不斷積累，后期叢芽誘導與增殖可適當降低6-BA刺激濃度和時間。

在未附加其他外源激素的情況下，對MS培養(yǎng)基中大量元素進行梯度配比，40 d時試管苗均有不同程度的生根現(xiàn)象，說明迎春櫻為易生根植物;以3/4MS為基本培養(yǎng)基，NAA濃度對迎春櫻不定根的粗細、健壯有影響，NAA濃度為 0.04～0.08 mg/L時，生根率為91.5%～100.0%，不定根較多，莖葉健壯，為迎春櫻的合適生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)40 d左右時，將生根苗直接開瓶移栽于V細沙 ∶ V珍珠巖 ∶ V蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1 組成的基質(zhì)的穴盤中，20 d時成活率為93.8%，新生真葉2～3張，成活率高，生長健壯;45 d左右進行大田移栽，成活率在90%以上。

本研究表明，高濃度的6-BA可有效促進愈傷組織的產(chǎn)生，而迎春櫻通過愈傷組織獲得胚體再生相當困難，植物遺傳轉化的眾多研究已證明，通過愈傷組織再生系統(tǒng)轉化率較高。因此，在本研究的基礎上，通過愈傷組織開展迎春櫻胚體再生體系研究成為開展轉基因工作的重要環(huán)節(jié)[16]，是迎春櫻組培快繁尚需攻關完善的環(huán)節(jié)，同時，為使理論更好地應用于生產(chǎn)，迎春櫻組培苗大田移栽后，后期成活率高低、生長健壯與否、個體變異情況是后續(xù)仍須深入研究的課題。

參考文獻：

[1]俞德浚，陸玲娣，谷粹芝，等. 中國植物志：第38卷[M]. 北京：科學出版社，1986：46-89.

[2]王賢榮. 國產(chǎn)櫻屬分類學研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學，1997：56-58.

[3]南程慧. 迎春櫻居群變異與繁殖生物學研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學，2012：138-155.

[4]南程慧，王賢榮，湯庚國，等. 迎春櫻組培無菌外植體獲得方法初探[J]. 湖北民族學院學報（自然科學版），2010，28（3）：251-255.

[5]王沙生，高榮孚，吳貫明. 植物生理學[M]. 2版.北京：中國林業(yè)出版社，1990：303-306.

[6]Kris P，Tess A，Jerzy N. Tissue culture propagation of Mongolian cherry（Prunus fruticosa）and Nanking cherry（Prunus tomentosa）[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2005，82（2）：207-211.

[7]Ning G G，F(xiàn)an X L，Huang W J，et al. Micropropagation of six Prunus mume cultivars through high-frequency axillary shoot proliferation and ISSR analysis of cloned plants[J]. Acta Biologica Cracoviensia，2007，49（1）：25-31.

[8]李 勇，方揚輝，鄭雪燕，等. 福建山櫻花組培快繁技術[J]. 林業(yè)科技開發(fā)，2015，29（1）：20-23.

[9]李 蒙. 山櫻花高海拔居群生態(tài)學特征及組織培養(yǎng)[D]. 南京：南京林業(yè)大學，2013：70-80.

[10]王光萍，黃敏仁. 福建山櫻花的組織培養(yǎng)及植株再生[J]. 南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2002，26（2）：73-75.

[11]呂月良，陳 璋，施季森，等. 福建山櫻花不定芽誘導和植株再生規(guī)?；敝吃囼瀃J]. 南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2006，30（3）：105-108.

[12]閆道良，王賢榮，欽 佩，等. 鐘花櫻組織培養(yǎng)再生體系的建立[J]. 林業(yè)科技開發(fā)，2006，20（3）：21-24.

[13]榮冬青，王賢榮. 垂枝早櫻“紅枝垂”組培快繁試驗[J]. 林業(yè)科技開發(fā)，2008，22（5）：72-75.

[14]和鳳美，朱永平，楊曉紅，等. 冬櫻花愈傷組織誘導和抑制褐化初探[J]. 中國農(nóng)學通報，2010，26（12）：130-134.

[15]高新一，王玉英. 植物無性繁殖實用技術[M]. 北京：金盾出版社，2003：319-454.

[16]譚 彬，郭水歡，韓亞萍，等. 毛桃葉片愈傷組織誘導[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（5）：37-40.陳園媛，姚金澳，崔永一. 金線蓮一次性成苗技術研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（1）：52-55.