程鴻燕 郭昱 馬芳芳

摘要：基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并結(jié)合谷子基因組數(shù)據(jù)庫鑒定出10個候選NCED基因，對它們的結(jié)構(gòu)特點、理化性質(zhì)、啟動子元件功能等進(jìn)行分析，并以抗旱（GG）和干旱敏感谷子品種（JF16）為材料，對PEG脅迫前后差異基因的表達(dá)特點進(jìn)行分析。結(jié)果表明，谷子中編碼NCED家族基因啟動子中含較多與抗旱脅迫相關(guān)的功能元件;經(jīng)PEG脅迫處理后，Seita.2G035400在GG和JF16中表達(dá)量均上調(diào)，但上調(diào)幅度有所差異。該研究結(jié)果進(jìn)一步加強了對植物NCED基因家族的了解，也為后續(xù)進(jìn)行谷子抗旱機制和抗旱分子育種提供了理論借鑒依據(jù)。

關(guān)鍵詞：谷子;NCED家族基因;干旱脅迫;表達(dá);生物信息學(xué)

中圖分類號： S515.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0040-04

谷子[Setaria italica （L.） P. Beauv.]是禾本科狗尾草屬的糧草兼用作物，最早被馴化種植于中國北方，已有8 700多年的栽培史[1]，其營養(yǎng)價值高，富含人體所需的類胡蘿卜素、氨基酸、葉酸和硒等成分[2]，至今仍被譽為“五谷之首”。谷子葉面積小、自花授粉、蒸騰效率和水分利用效率高，具有耐干旱、耐貧瘠特性[3]。但是近年來，隨著全球氣候變暖，可利用水資源日趨匱乏，干旱成為制約作物正常生長發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。

發(fā)掘谷子耐旱基因，了解其基因家族在干旱脅迫條件下的表達(dá)模式，對谷子抗旱新品種選育具有極為重要的指導(dǎo)作用。作物在干旱、鹽堿、低溫、凍害等非生物脅迫條件下，可通過自身調(diào)節(jié)來適應(yīng)或抵制這些脅迫[4-5]。脫落酸（abscisic acid，ABA）作為一種植物激素，是一種極為重要的逆境信號，不僅在植物生長發(fā)育過程不同階段起重要作用，而且在干旱、低溫、衰老、鹽漬等多種逆境響應(yīng)中起著重要調(diào)控作用，可通過介導(dǎo)葉片氣孔關(guān)閉過程來抵御干旱脅迫[6-7]。

9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）屬于類胡蘿卡素雙加氧裂解酶 （carotenoid cleavage dioxygenases，CCDs）家族成員，被認(rèn)為是高等植物ABA生物合成過程中最重要的限速酶，有研究表明其表達(dá)量與植物體內(nèi)ABA含量呈正相關(guān)[8-10]。編碼NCED的基因最初是從玉米突變體viviparousl4（vpl4）中被克隆[11]，隨后在其他植物如番茄[12]、豇豆[13]、擬南芥[8，14]、柱花草[15]等中也克隆得到了NCED基因。近年來，我國在NCED響應(yīng)小麥、擬南芥、花生、煙草、水稻等作物干旱脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可以誘導(dǎo)NCED基因表達(dá)和內(nèi)源ABA的積累，且在一定范圍內(nèi)，該基因表達(dá)與ABA積累隨脫水延長而明顯增強[16-20]，這說明NCED基因在提高植物抗旱能力方面具有重要研究價值。

谷子是重要的抗逆模式作物，目前，尚無對谷子中NCED家族進(jìn)行系統(tǒng)研究的相關(guān)報道，干旱脅迫下谷子NCED基因家族情況及其結(jié)構(gòu)特點和表達(dá)特征并不明晰。本研究以耐旱品種勾勾母雞咀（GG）和干旱敏感品種晉汾16（JF16）為試驗材料，在人工氣候室模擬晝夜條件對其進(jìn)行培養(yǎng)，于苗期進(jìn)行20%聚乙二醇6000（PEG-6000）模擬干旱處理后取材，用于表達(dá)譜測序。從中找到抗旱相關(guān)基因NCED后，利用生物信息學(xué)方法從谷子基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定同源NCED基因，并系統(tǒng)分析其基因家族成員的結(jié)構(gòu)特點、理化特性、啟動子調(diào)控元件、進(jìn)化關(guān)系以及該基因家族成員在干旱脅迫下的表達(dá)特點，旨在為進(jìn)一步研究谷子抗旱分子育種提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用植物材料為耐旱性品種勾勾母雞咀（GG）和干旱敏感性品種晉汾16（JF16），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所提供。將這2個品種種植在混合均勻的基質(zhì)（營養(yǎng)土 ∶ 蛭石=3 ∶ 1）上，然后將其放于人工氣候室，模擬外界晝夜條件進(jìn)行14 h光培養(yǎng)（28 ℃）和10 h暗培養(yǎng)（23 ℃），出苗培養(yǎng)21 d后，將2個品種谷子幼苗用一定量的20% PEG-6000模擬干旱脅迫處理0.5 h，而對照組幼苗用同等量的蒸餾水處理相同時間。之后在對照組和處理組中的每個品種中分別隨機取出3株幼苗，進(jìn)行RNA提取和表達(dá)譜測序。

1.2 試驗方法

根據(jù)表達(dá)譜測序結(jié)果查詢到NCED基因名，并通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)和代謝途徑，明確其注釋功能;利用Phytozome v 12.1（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，查找NCED基因家族信息。利用GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析;利用ExPASY（https：//web.expasy.org）軟件對谷子NCED基因家族的蛋白質(zhì)分子量和理論等電點等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析;利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測谷子NCED基因家族啟動子（基因上游1 500 bp序列）相關(guān)元件并進(jìn)行統(tǒng)計;采用MAGA 7.0軟件對谷子NCED蛋白及擬南芥、水稻、小麥和玉米等近源物種中NCED蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行親緣關(guān)系比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子NCED基因的基本信息及結(jié)構(gòu)分析

在Phytozome v12.1的谷子數(shù)據(jù)庫中找到10個NCED家族基因，并對其基本信息（染色體位置、CDS序列和氨基酸序列）進(jìn)行統(tǒng)計與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷子NCED家族基因分布在不同的染色體上，其中1號、4號和9號染色體上各包含1個成員，2號和3號染色體上各包含2個成員，5號染色體上的NCED家族基因最多，為3個（表1）。谷子NCED家族基因CDS序列的平均長度為1 773 bp，不同成員的CDS序列長度之間也存在差異，其中Seita. 9G156500的CDS序列最長，為1 965 bp;Seita. 3G408300的CDS序列最短，為1 638 bp（表1）。

為進(jìn)一步分析谷子NCED家族基因的結(jié)構(gòu)特征，使用GSDS 2.0軟件對NCED家族成員的基因序列和CDS序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，NCED家族不同成員之間的結(jié)構(gòu)存在較大差異，其中Seita. 2G035400和Seita. 3G391000具有相同的結(jié)構(gòu)，都沒有內(nèi)含子和上下游，只有編碼區(qū)序列;其余8個基因都含有內(nèi)含子和編碼區(qū)序列，但數(shù)目差異較大，并且Seita. 1G288400和Seita. 4G062800與其余6個基因結(jié)構(gòu)差異更大，未發(fā)現(xiàn)上下游結(jié)構(gòu)（圖1）。

2.2 谷子NCED理化性質(zhì)

根據(jù)豫谷1號NCED的cDNA序列預(yù)測到的氨基酸序列可知，谷子NCED家族基因氨基酸序列的平均長度為590 aa，而不同成員的氨基酸序列長度之間存在差異，其中Seita. 9G156500的氨基酸序列最長，為654 aa;Seita. 3G408300的氨基酸序列最短，為545 aa（表1）。蛋白質(zhì)分子量在 60 585.91～70 862.56 ku之間，平均值為64 656.88 ku，其中Seita. 9G156500的蛋白質(zhì)分子量最大（70 862.56 ku），Seita. 5G315700的蛋白質(zhì)分子量最?。?0 585.91 ku）;等電點介于5.81（Seita. 4G062800）～7.66（Seita. 5G315700）之間，均值為6.37，并且除Seita. 5G315700的蛋白質(zhì)等電點呈弱堿性外，其余9個均呈酸性，可見它們發(fā)揮其最大催化活性的最適pH值有所差異（表1）。

2.3 谷子NCED基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

為進(jìn)一步分析谷子NCED基因家族之間及其與其他植物NCED之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，了解其進(jìn)化過程，將所得到的谷子NCED基因編碼的蛋白序列與其他物種（水稻、玉米、高粱、擬南芥、大麥、小麥和狗尾草）進(jìn)行BLAST蛋白同源性檢索，并下載其他物種的NCED蛋白序列，之后將其與谷子NCED基因家族成員進(jìn)行比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷子NCED基因家族中，Seita. 5G315800、Seita. 5G315600和Seita. 5G315700單獨聚為一大類，暗示這3個基因雖然與谷子中一些基因親緣關(guān)系較近，但在進(jìn)化過程中它們所編碼的蛋白序列存在較多氨基酸變異位點;而其余7個基因與其他7個物種的NCED聚為一大類，說明谷子的這7個基因親緣關(guān)系較近，并且在這一大類中，谷子Seita. 2G035400與狗尾草中NCED基因 （Sevir. 2G040100）是相同的，它們與高粱的NCED親緣關(guān)系最近，與水稻、小麥的親緣關(guān)系次之;谷子Seita. 9G156500與大麥NCED的親緣關(guān)系最近;谷子Seita. 3G391000與玉米NCED的親緣關(guān)系最近;而Seita. 9G156500和Seita. 3G391000與擬南芥NCED的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近各次于大麥和玉米。這一結(jié)果與植物經(jīng)典分類結(jié)果相一致。

2.4 谷子NCED家族基因啟動子調(diào)控元件功能分析

通過PlantCARE軟件對谷子NCED家族基因啟動子（基因上游1 500 bp）順式作用元件進(jìn)行功能預(yù)測，有利于進(jìn)一步鑒定該家族基因在谷子抗旱機制中所起的作用。本研究主要對激素響應(yīng)元件和逆境脅迫響應(yīng)元件進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果（表2）表明，每個基因啟動子中均含有厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件，有部分基因啟動子中含有低溫響應(yīng)和熱響應(yīng)元件;除基因Seita. 5G315600外，其余9個基因啟動子中均含有ABA響應(yīng)元件;除基因Seita. 9G156500、Seita. 1G288400和Seita. 3G408300外，其余7個基因均含有MeJA響應(yīng)元件，并且Seita. 5G315800中最多（為12個）;有5個基因啟動子中含有SA響應(yīng)元件，它們分別是Seita. 3G391000、Seita. 3G408300、Seita. 2G174500、Seita. 5G315600和Seita. 5G315700;除基因Seita. 2G035400、Seita. 9G156500和Seita. 2G174500外，其余7個基因啟動子中均含有GA響應(yīng)元件，并且Seita. 4G062800中最多（為3個）;有5個基因啟動子均含有MYB響應(yīng)元件，它們分別是Seita. 9G156500、Seita. 3G391000、Seita. 2G174500、Seita. 5G315800和Seita. 5G315600。

2.5 谷子NCED家族基因成員在干旱脅迫下的表達(dá)模式

對谷子幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理后，根據(jù)表達(dá)譜測序結(jié)果，對勾勾母雞咀和晉汾16中NCED基因表達(dá)量進(jìn)行分析，這2個品種中均含有Seita.2G035400基因。從圖3中可以看出，GG和JF16經(jīng)不同處理后其體內(nèi)Seita.2G035400基因均有表達(dá)，并且經(jīng)干旱脅迫處理后該基因的表達(dá)量與對照相比均升高，但該基因在干旱敏感性品種JF16中表達(dá)量增幅明顯高于在耐旱品種GG中表達(dá)量增幅（圖3）。

3 討論與結(jié)論

脫落酸ABA與植物生長發(fā)育調(diào)控、氣孔開閉以及對逆境適應(yīng)和抵御之間關(guān)系密切，是一種尤為重要的激素調(diào)節(jié)物質(zhì)[21-22]。因此，有必要分析ABA生物合成關(guān)鍵基因，明確其家族基因結(jié)構(gòu)與功能，掌握其在ABA生物合成中所起作用，進(jìn)而通過調(diào)控植物體內(nèi)ABA含量來達(dá)到植物自身生理調(diào)控目的。NCED基因就是參與ABA生物合成調(diào)控的一類關(guān)鍵基因[9]。

從谷子NCED家族基因啟動子元件功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，有很多調(diào)控元件與植物干旱脅迫響應(yīng)物質(zhì)有關(guān)，如ABRE和motif IIb（CCGCCGCGCT）是ABA響應(yīng)元件，而ABA可通過調(diào)節(jié)氣孔開閉或者促進(jìn)根系對水分吸收等途徑來調(diào)控植物對干旱脅迫的適應(yīng)性，Neill等研究認(rèn)為，ABA是植物的抗逆誘導(dǎo)因子[23];CGTCA-motif和TGACG-motif為茉莉酸甲酯（methyl-jasmonate，MeJA）響應(yīng)元件，而研究報道MeJA在代謝和生理調(diào)控上類似于植物激素脫落酸的作用[24]，它可以提高作物抗旱性[25];TCA-element是水楊酸（salicylic acid，SA）響應(yīng)元件，水楊酸是植物內(nèi)源信號分子之一，可通過減少植物體內(nèi)細(xì)胞自由基積累和減輕細(xì)胞膜脂過氧化等途徑來緩解干旱脅迫對植物自身的影響。陶宗婭等通過對干旱脅迫下的小麥外施一定濃度的SA發(fā)現(xiàn)，SA具有緩解干旱作用[26];TATC-box是赤霉素（gibberellin acid，GA）響應(yīng)元件，用一定濃度GA對煙草種子進(jìn)行引發(fā)處理后可提高其種子和幼苗的抗旱性[27];MBS（TAACTG和CAACTG）是MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點響應(yīng)元件，MYB轉(zhuǎn)錄因子與植物抗逆脅迫有關(guān)，據(jù)報道，擬南芥中ATMYB41在干旱、ABA和鹽脅迫處理下高水平表達(dá)[28]。此外，HSE（AAAAAATTT）和LTR（CCGAAA）分別是熱脅迫和低溫脅迫響應(yīng)元件，TC-rich repeats（ATTCTCTAAC）是脅迫調(diào)控相關(guān)元件。因此可以推測谷子生長發(fā)育過程中通過這些調(diào)控元件共同作用來響應(yīng)干旱、低溫等逆境脅迫。

從本試驗中對NCED家族中Seita.2G035400基因表達(dá)量的分析可以看出，在正常澆水條件下，2個品種谷子GG和JF14中Seita.2G035400表達(dá)量很低或者幾乎不表達(dá)，干旱脅迫后誘導(dǎo)該基因大量表達(dá)（圖3），說明該基因響應(yīng)干旱脅迫，并且在耐旱品種與干旱敏感品種中所起作用相同，只是由于表達(dá)量的差異而引起這2個谷子品種的抗旱能力不同。這與前人研究結(jié)果相一致，前人研究報道已證明NCED基因經(jīng)干旱脅迫后大量表達(dá)，并通過調(diào)控植物內(nèi)源ABA含量來抵御干旱脅迫[14，29-30]。

綜上所述，本研究基于PEG脅迫后谷子表達(dá)譜數(shù)據(jù)和Phytozome谷子基因組數(shù)據(jù)庫，鑒定出10個谷子NCED基因，運用生物信息學(xué)方法對其基本信息、結(jié)構(gòu)特點、蛋白理化性質(zhì)和啟動子元件功能等進(jìn)行了分析預(yù)測，并對其中一個基因Seita.2G035400在干旱脅迫條件下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，研究結(jié)果為谷子抗旱分子育種提供了理論借鑒基礎(chǔ)，后期研究有望通過克隆谷子中NCED基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在谷子中過量表達(dá)，并通過耐旱性篩選試驗來驗證基因功能。

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