文/J.Stephenson，C.Bladen

可一步完成抗體澄清和除菌過(guò)濾 // 單克隆抗體被具有極其廣泛的應(yīng)用，無(wú)論是用于基礎(chǔ)研究還是生物制藥。時(shí)至今日，收獲哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液依然是項(xiàng)耗時(shí)的工作，尤其是在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模不大，并且還要涉及離心過(guò)程。但如今，采用新式硅藻土過(guò)濾解決方案可顯著改善并加快該過(guò)程。

單克隆抗體（mAb）被廣泛地應(yīng)用在生物藥開(kāi)發(fā)、基礎(chǔ)研究和體外診斷上。單克隆抗體的表達(dá)系統(tǒng)通常利用信號(hào)肽來(lái)確?？贵w分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。雖然該方法可降低純化操作的復(fù)雜程度，避免細(xì)胞破碎，卻需要使用各種成本昂貴、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的技術(shù)來(lái)將細(xì)胞與含有抗體的培養(yǎng)液分離。方法通常涉及生產(chǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗體，無(wú)論是使用雜交瘤的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)，還是使用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）或人胚腎細(xì)胞系（HEK）的重組生產(chǎn) ，使用的生物反應(yīng)器規(guī)模一般大于50 L，采用連續(xù)離心和深層過(guò)濾等工藝進(jìn)行操作。

然而，在研究開(kāi)發(fā)上，通常每種抗體僅需要不到10 L的細(xì)胞培養(yǎng)液，因此這些過(guò)程不僅成本昂貴，而且不切合實(shí)際。所以在研究開(kāi)發(fā)上使用最廣泛的方法是先使用離心機(jī)進(jìn)行澄清操作，接著使用手動(dòng)注射器或真空瓶口過(guò)濾器將上清液分別注入0.20、0.22或0.45μm 過(guò)濾器中進(jìn)行過(guò)濾。該方法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，易于操作，可與大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備配合使用。但是，這些過(guò)濾器并非采用深層設(shè)計(jì)，因此懸浮液中殘留的亞微顆粒易于堵塞過(guò)濾器。作為一家專注于抗體表達(dá)、測(cè)序和工程的公司，Absolute Antibody則使用HEK293和CHO-K1細(xì)胞實(shí)現(xiàn)重組抗體瞬時(shí)表達(dá)。

該公司的實(shí)驗(yàn)室每周通?？芍苽?0種抗體，規(guī)模從30 mL到20 L，每周總產(chǎn)量約為100 L細(xì)胞。在過(guò)去的6年中，實(shí)驗(yàn)室專家一直使用離心后再用瓶口過(guò)濾裝置過(guò)濾的方法來(lái)制備所有抗體。隨著Absolute Antibody產(chǎn)量的提升，對(duì)離心機(jī)數(shù)量的需求也隨之增加。在此期間，實(shí)驗(yàn)室工程師研究了眾多替代方案，包括使用專為室內(nèi)釀造和絮凝劑（例如幾丁聚糖）而設(shè)計(jì)的過(guò)濾器。這些方法都被證明效率低下，不能滿足實(shí)驗(yàn)需求。

為降低澄清哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液所用的時(shí)間和工作量，賽多利斯集團(tuán)專門(mén)研制出了一款Sartoclear Dynamics Lab V 過(guò)濾系統(tǒng)。向培養(yǎng)液中添加硅藻土（DE）有助于多孔濾餅成型防止堵塞過(guò)濾器，并快速移除樣本中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，見(jiàn)圖1。因此，該過(guò)程中無(wú)需離心操作，避免了離心機(jī)容量和可用性方面的問(wèn)題，同時(shí)還防止了過(guò)濾器堵塞。接著，測(cè)試Sartoclear Dynamics Lab V過(guò)濾系統(tǒng)，并與公司的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程進(jìn)行比較。

材料和方法

懸浮的HEK293或CHO細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并使用可編碼單克隆抗體的重輕鏈的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。經(jīng)過(guò)6到14天轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行純化操作，可收獲細(xì)胞。對(duì)于1 L的規(guī)模為例，首先在臺(tái)式離心機(jī)中按照3.500 kg的重量要求，進(jìn)行離心操作45 min，并使用1個(gè)或多個(gè)真空 PES 0.45μm瓶口過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。將過(guò)濾后的上清液加載至具有5 ml蛋白A柱的?KTA蛋白純化儀中，以捕獲抗體，并在低pH緩沖液中洗脫。隨后，中和抗體，并進(jìn)行其他純化操作（例如，陽(yáng)離子交換劑或尺寸排阻色譜法）或者直接按照特定批次抗體的要求進(jìn)行質(zhì)量控制。

質(zhì)量控制手段包括：非還原和還原性SDS-PAGE、SEC-HPLC、內(nèi)毒素檢測(cè)，必要時(shí)可使用ELISA測(cè)量結(jié)合活性，見(jiàn)圖2。

在改進(jìn)的下游工藝中，可使用Sartoclear Dynamics Lab V代替離心和過(guò)濾操作。如果是1 L的細(xì)胞培養(yǎng)液，可向其中添加20 g的DE。充分混合細(xì)胞和DE后，直接將其添加至 Sartoclear Dynamics Lab包裝中附帶的1000 mL PES 0.22 μm Sartolab RF真空過(guò)濾器中。施加真空，并將澄清的細(xì)胞培養(yǎng)液收集在1 L的瓶中。按照上述的純化和質(zhì)控過(guò)程對(duì)濾液進(jìn)行處理。

圖1 使用常規(guī)過(guò)濾和Sartoclear Dynamics Lab過(guò)濾方法澄清細(xì)胞培養(yǎng)液的原理。

圖2 Absolute Antibody公司生產(chǎn)重組抗體的下游處理工作流程。

結(jié)果與討論

為了將Sartoclear Dynamics Lab V與標(biāo)準(zhǔn)工藝進(jìn)行對(duì)比，可使用HEK293細(xì)胞制備2 L的人源化抗EGFR IGG1抗體（西妥昔單抗：Absolute Antibody 產(chǎn)品目錄編號(hào)Ab00279-10.0）。經(jīng)過(guò)6天的轉(zhuǎn)染后，將培養(yǎng)液平均分成兩份。細(xì)胞收獲時(shí)，細(xì)胞密度為2.4×106cells/mL，存活率為65%。

使用常規(guī)工藝方法對(duì)其中1L細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行處理，包括45 min的離心操作，接著使用三個(gè)0.45μm PES 500 mL瓶口過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。這些過(guò)濾器通常在過(guò)濾了400 mL上清液后出現(xiàn)堵塞，意味著每升細(xì)胞培養(yǎng)液平均需要三個(gè)過(guò)濾器。該過(guò)程中并未使用孔徑大小為0.22μm的過(guò)濾器，以便在發(fā)生堵塞前提高上清液的過(guò)濾容量。過(guò)濾1L細(xì)胞需要9 min，其中包括48 s的手動(dòng)操作時(shí)間，因此將整體工藝時(shí)間延長(zhǎng)至約55min。

使用Sartoclear Dynamics Lab V處理另外1 L細(xì)胞培養(yǎng)液。將兩袋10 g的DE加入細(xì)胞中，然后充分混合。將細(xì)胞倒入1000 mL 0.22μm Sartolab RF過(guò)濾器中并施加真空。整個(gè)過(guò)濾過(guò)程中并未出現(xiàn)堵塞，從添加DE到完成過(guò)濾，總計(jì)耗時(shí)8 min27 s。這表明該方法大約只需傳統(tǒng)方法處理時(shí)間的15%，如圖3所示。

圖3 根據(jù)處理時(shí)間對(duì)比澄清操作。

為了確認(rèn)Sartoclear Dynamics Lab V工藝對(duì)抗體質(zhì)量無(wú)影響，分別使用兩個(gè)樣本進(jìn)行純化和質(zhì)量控制。最后純化后的抗體顯示，使用SDS-PAGE,見(jiàn)圖5(在線）或SECHPLC，見(jiàn)圖6（在線）確認(rèn)并未檢測(cè)到產(chǎn)品差異。測(cè)量每種樣本的內(nèi)毒素，兩者的讀數(shù)均小于0.05 EU/mg，這是使用試劑盒通常會(huì)檢測(cè)到的最低下限。

為了確認(rèn)改進(jìn)后的工藝對(duì)抗體功能無(wú)影響，使用間接ELISA以展示人體EGFR-Fc間的結(jié)合性（Absolute Antibody 產(chǎn)品目錄編號(hào)Pr00117-10.9）。如圖4所示，細(xì)胞澄清方法對(duì)結(jié)合活性無(wú)影響。此外，兩種方法所獲得最終產(chǎn)量幾乎相同，表明DE對(duì)抗體的質(zhì)量和數(shù)量無(wú)影響。

LP本刊提示

無(wú)需離心操作即可輕松過(guò)濾

Sartoclear Dynamics Lab是一種創(chuàng)新解決方案，適用于在實(shí)驗(yàn)室中預(yù)過(guò)濾掉細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞碎片后再進(jìn)行除菌過(guò)濾。采用Sartoclear Dynamics Lab提供的解決方案可一次性完成哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液澄清和除菌過(guò)濾。該即用型產(chǎn)品完全無(wú)需進(jìn)行離心操作，因此可簡(jiǎn)化澄清過(guò)程。利用該技術(shù)可在幾分鐘內(nèi)高效澄清并對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行除菌操作。

結(jié)論

Sartoclear Dynamics Lab V可快速澄清哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液，無(wú)需離心操作。使用抗體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染兩升的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后分別使用基于標(biāo)準(zhǔn)離心澄清工藝和基于硅藻土方法進(jìn)行處理后對(duì)比，可得出上述結(jié)論。

使用一系列測(cè)量方法（SDSPAGE, SEC-HPLC, ELISA和內(nèi)毒素）確認(rèn)最終產(chǎn)品的數(shù)量或質(zhì)量，并未檢測(cè)到任何有意義的差異，表明基于硅藻土的方法對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量無(wú)影響。重要的是，Sartoclear Dynamics Lab V 工藝可顯著節(jié)省約85%的時(shí)間。這使得Sartoclear Dynamics Lab V成為頗具吸引力的選擇，可提高澄清分泌蛋白質(zhì)表達(dá)和純化系統(tǒng)的生產(chǎn)效率和通量。