盧艷艷 王超 侍福梅

摘要：蛋白質(zhì)作為細(xì)胞活性及功能的執(zhí)行者，以復(fù)雜有序的動(dòng)態(tài)互作協(xié)調(diào)著細(xì)胞的增殖與分化、衰老與死亡以及環(huán)境應(yīng)答等各種重要生理過(guò)程。重點(diǎn)介紹了酵母雙雜交系統(tǒng)、雙分子熒光互補(bǔ)、噬菌體展示技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白沉降技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)等蛋白質(zhì)互作研究技術(shù)的原理及在生物學(xué)中的應(yīng)用，以及生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)互作研究中的應(yīng)用，并對(duì)目前及未來(lái)蛋白質(zhì)互作技術(shù)的發(fā)展方向進(jìn)行了探討。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì);生物信息;蛋白質(zhì)互作

中圖分類(lèi)號(hào)：Q51? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）12-0005-06

Abstract： Proteins，the true executer of cell activities and functions， play important roles in the proliferation， differentiation， aging and death， and environmental response via complex and highly ordered dynamic interaction. The basic principles and applications of several related research techniques in protein-protein interactions， including yeast two-hybrid system， bimolecular fluorescence complementation assay， phage display technology， fluoresence energy transfer， GST Pull-down， co-immunoprecipitation， and bioinformatics in protein interaction research applications， and their development prospects were also prospected.

Key words： protein; bioinformatics; protein interaction

2003年4月，人類(lèi)基因組測(cè)序的完成，標(biāo)志著生命科學(xué)正式進(jìn)入后基因組時(shí)代，生命科學(xué)從單純研究基因序列信息轉(zhuǎn)向?qū)蚬δ艿纳钊虢馕?，蛋白質(zhì)組學(xué)成為研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)不能單獨(dú)發(fā)揮作用，需依靠蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用發(fā)揮功能。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用即蛋白質(zhì)互作（Protein-protein interaction，PPI）是細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)重要組成部分，在新蛋白質(zhì)及相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)、鑒定與功能驗(yàn)證，以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞代謝等研究方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要區(qū)域。通過(guò)PPI發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)不同的熱激蛋白質(zhì)家族成員都廣泛參與凋亡信號(hào)通路[1];線(xiàn)粒體抗病毒信號(hào)蛋白質(zhì)（MAVS）作為一種接頭蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)宿主天然免疫信號(hào)通路過(guò)程中扮演著重要角色[2]。

蛋白質(zhì)本身是多種多樣的，每種蛋白質(zhì)的獨(dú)特生理屬性影響著蛋白質(zhì)間的相互作用，在體外試驗(yàn)分析重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)內(nèi)含物的形成從而妨礙其功能的實(shí)現(xiàn)[3]。蛋白質(zhì)間的互作也存在不同層次的復(fù)雜性，如：多亞基酶的納米機(jī)制[4]、分子伴侶與靶蛋白質(zhì)的互作[5]、蛋白質(zhì)激酶與靶蛋白質(zhì)互作[6]、代謝網(wǎng)絡(luò)中多種蛋白質(zhì)的互作[7]。因此，完全精準(zhǔn)解讀蛋白質(zhì)的相互作用原理及功能，需要更加高效科學(xué)的PPI技術(shù)。

1? 蛋白質(zhì)互作技術(shù)

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，PPI技術(shù)得到了極大改善，試驗(yàn)過(guò)程變得簡(jiǎn)化，試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。目前PPI技術(shù)主要包括酵母雙雜交（Yeast Two-hybrid）系統(tǒng)、雙分子熒光互補(bǔ)（Bimolecular Fluorescence Complementation Assay，BiFC）、噬菌體展示技術(shù)（Phage Display Technology，PDT）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)、胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白沉降（Glutathione S-transferase Pull-down Assay，GST Pull-down Assay）技術(shù)、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）技術(shù)和Far-western blotting等多種研究PPI的技術(shù)。

1.1? 酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母雙雜交是1989年由Fields等[8]首次應(yīng)用在真核生物酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4特性的研究中。酵母雙雜交技術(shù)是建立在模式生物酵母之上，原理是酵母細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，其在結(jié)構(gòu)上是組件式的，有2個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA Binding Domain，DNA-BD）[9]和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Transcription Activation Domain，AD）[10]，DNA-BD和AD單獨(dú)存在沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活功能。將2個(gè)蛋白質(zhì)基因分別連接到BD與AD區(qū)域，若它們?cè)诳臻g上無(wú)限接近，則會(huì)形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄激活因子恢復(fù)活性，功能激活，BD區(qū)域可識(shí)別酵母轉(zhuǎn)錄激活因子上游激活序列（Upstream Activation Sequence，UAS），轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物激活UAS下游的報(bào)告基因使之轉(zhuǎn)錄[11]，根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)與否可以判斷PPI的結(jié)果，進(jìn)而測(cè)得未知蛋白質(zhì)的功能。

酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)之間的微弱、瞬間作用敏感度較高，因此在許多生物學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8，12]。李明智等[13]利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選水稻組蛋白質(zhì)去乙?；窰DA705的互作蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步揭示HDA705的生物學(xué)功能提供了關(guān)鍵線(xiàn)索;Silva等[14]利用酵母雙雜交技術(shù)驗(yàn)證了磷蛋白質(zhì)與磷酸酶1之間的相互作用;陳澤良等[15]應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)初步篩選出與埃博拉病毒VP24、VP35、VP40相互作用的宿主蛋白質(zhì)，并完成了初步功能分析。

酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)互作的所有方法中較為簡(jiǎn)便、靈敏和高效的一種方法[16]，但仍存在一些局限性。傳統(tǒng)的酵母雙雜交只能檢測(cè)發(fā)生于核內(nèi)的相互作用[17];在試驗(yàn)中，經(jīng)常遇到假陽(yáng)性，并且其轉(zhuǎn)化效率不高，仍需進(jìn)一步優(yōu)化。目前，酵母雙雜交系統(tǒng)衍生出了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)、核外雙雜交系統(tǒng)、反向雙雜交系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)等技術(shù)[18]，未來(lái)酵母雙雜交系統(tǒng)在生物學(xué)研究領(lǐng)域尤其是生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用將更加深入。

1.2? 雙分子熒光互補(bǔ)

雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）是在2002年由Hu等[19]提出的一種觀(guān)察植物活細(xì)胞間PPI的方法。BiFC是基于兩段不完整的熒光報(bào)告蛋白質(zhì)互補(bǔ)片段重新結(jié)合成完整的報(bào)告蛋白質(zhì)，并發(fā)出熒光的過(guò)程。該試驗(yàn)為觀(guān)察活細(xì)胞中蛋白質(zhì)間的相互作用和修飾提供了一種有效的方法。

BiFC技術(shù)的原理是利用熒光蛋白質(zhì)基因的某些特定位點(diǎn)，將其切成2個(gè)不具熒光活性的N-端和C-端2個(gè)片段，使2個(gè)片段分別與目標(biāo)蛋白質(zhì)基因連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞融合表達(dá)，如果2個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)存在相互作用，便能夠相互接近，重新形成具用熒光活性的蛋白質(zhì)，從而發(fā)射熒光，反之，目標(biāo)蛋白質(zhì)之間則沒(méi)有相互作用。

自從Ghosh等[20]報(bào)道了綠色熒光蛋白質(zhì)（Green Fluorescent Protein，GFP）通過(guò)N-末端和C-末端的重新組裝產(chǎn)生綠色熒光以來(lái)，BiFC技術(shù)得到很大的改進(jìn)和發(fā)展。例如，多色熒光互補(bǔ)技術(shù)（Multicolor）能夠研究多種蛋白質(zhì)間的相互作用。隨著B(niǎo)iFC技術(shù)的完善，在生物學(xué)研究中的應(yīng)用逐漸增多。曹建美[21]利用BiFC解析了玉米MAPK5與bZIP72蛋白質(zhì)之間的相互作用;劉文曉等[22]在活細(xì)胞中通過(guò)BiFC直接觀(guān)察研究MICOS復(fù)合物中各組成蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系;Chen等[23]通過(guò)BiFC檢測(cè)了HIV-1與輔助因子蛋白質(zhì)以及上皮衍生生長(zhǎng)因子之間的相互作用，其相互作用顯著，這項(xiàng)研究提供了新的蛋白質(zhì)生理?xiàng)l件下的成像系統(tǒng)，并為抵抗HIV病毒的蛋白質(zhì)抑制劑類(lèi)藥物研發(fā)提供信息。到目前為止，已經(jīng)有超過(guò)10種BiFC分析技術(shù)的熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)。在活細(xì)胞Ca2+依賴(lài)蛋白質(zhì)互作的研究中，黃色熒光蛋白質(zhì)（Yellow Fluorescent Protein，YFP）的有效性首次被證明[24]，紅色熒光蛋白質(zhì)DsRed[25]被發(fā)現(xiàn)后關(guān)注較多，因?yàn)镈sRed的應(yīng)用延長(zhǎng)了BiFC分析的波長(zhǎng)范圍。

在一般情況下，BiFC技術(shù)相比其他PPI分析熒光互補(bǔ)試驗(yàn)具有幾個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[26，27]：BiFC可以研究未知結(jié)構(gòu)信息的蛋白質(zhì)間的相互作用，幾乎可以對(duì)任何需氧生物通過(guò)基因改造表達(dá)融合蛋白質(zhì)。BiFC復(fù)合物發(fā)射的熒光可以利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞分析儀等檢測(cè)，不需要精密儀器、數(shù)據(jù)處理和利用試劑把融合蛋白分開(kāi)。完整細(xì)胞的研究避免了在細(xì)胞分解過(guò)程中發(fā)生PPI的變化以及不同細(xì)胞隔室內(nèi)容物的混合，既可對(duì)單個(gè)細(xì)胞中的PPI進(jìn)行觀(guān)察，也可以對(duì)不同細(xì)胞中不同細(xì)胞過(guò)程的差異進(jìn)行研究。但是該技術(shù)也存在局限性，受到熒光基團(tuán)形成時(shí)間和熒光蛋白復(fù)合物穩(wěn)定性的限制。

1.3? 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)（PDT）最早是Smith[28]在1985年提出的，用絲狀噬菌體作為載體進(jìn)行分子生物學(xué)研究，并首次介紹了PDT。PDT是以噬菌體作為載體，利用基因工程技術(shù)將外源DNA片段連接到載體上，使外源DNA隨噬菌體衣殼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因一起表達(dá)，形成融合表達(dá)蛋白質(zhì)，展示在噬菌體表面的一項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)。

PDT是通過(guò)外源基因與噬菌體結(jié)構(gòu)基因融合表達(dá)（不影響結(jié)構(gòu)基因的活性），形成具有相對(duì)空間結(jié)構(gòu)和生物活性的融合蛋白質(zhì)，展示在噬菌體表面，利用靶標(biāo)蛋白質(zhì)，通過(guò)生物淘選的方法，使與靶標(biāo)蛋白質(zhì)特異結(jié)合的噬菌體被篩選出，然后利用篩選的噬菌體侵染大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行序列測(cè)定分析，獲得目的蛋白的功能信息，為下一步研究提供理論依據(jù)。

噬菌體技術(shù)廣泛應(yīng)用于驗(yàn)證PPI、臨床應(yīng)用[29]，抗體工程分離技術(shù)[30]，疫苗開(kāi)發(fā)[31]等方面。目前的PDT包含各種噬菌體的載體，包括M13、T7、T4和f1。而近幾年的有關(guān)報(bào)道也充分證明了噬菌體展示技術(shù)的廣泛應(yīng)用：利用噬菌體表面展示技術(shù)從人肝癌T7 cDNA文庫(kù)中篩選出能與人CD8～+T淋巴細(xì)胞特異結(jié)合的蛋白分子[32];通過(guò)PDT技術(shù)制備出來(lái)的流感病毒、蛇毒等的特異性中和抗體[33];利用T7噬菌體展示技術(shù)篩選與人腸道病毒71型3A蛋白相互作用的蛋白質(zhì)[34];運(yùn)用PDT篩選到了可用于多菌型麻風(fēng)病患者及潛在患者診斷的3段多肽[35]等。盡管PDT成本低、操作簡(jiǎn)單，但也存在一定的局限性，如噬菌體庫(kù)容量和分子多樣性有一定的限制，且文庫(kù)一旦建成，很難突變和重組，因而文庫(kù)中分子遺傳多樣性受到限制，細(xì)胞內(nèi)有毒分子很難得到表達(dá)。

1.4? 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

1948年由F？觟rster等[36]提出了熒光共振能量轉(zhuǎn)移這一理論，與GFP的應(yīng)用和改造使FRET技術(shù)得以在活細(xì)胞中廣泛應(yīng)用。1992年P(guān)rasher等[37]首次從維多利亞水母中分離并克隆了一種熒光物質(zhì)——GFP，后來(lái)，更多的熒光蛋白（CFP、BFP、YFP等）被發(fā)現(xiàn)，為FRET的實(shí)現(xiàn)提供了基礎(chǔ)。FRET是一種非輻射的能量轉(zhuǎn)移，可以定時(shí)、定量、定位、動(dòng)態(tài)地觀(guān)察活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用[38]。

以最常用的CFP、YFP為例，簡(jiǎn)單介紹FRET原理。CFP發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜存在重疊，兩者距離足夠近時(shí)，CFP的吸收波長(zhǎng)激發(fā)，CFP的發(fā)光基團(tuán)把能量共振轉(zhuǎn)移到Y(jié)FP的發(fā)光基團(tuán)，CFP因此發(fā)射的熒光減弱（消失），YFP發(fā)射熒光，2個(gè)熒光基團(tuán)能量轉(zhuǎn)移對(duì)空間位置的變化感應(yīng)非常靈敏。若要研究A、B蛋白間的相互作用，可以依據(jù)FRET的原理構(gòu)建融合蛋白質(zhì)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括CFP、B蛋白質(zhì)、YFP。當(dāng)A、B蛋白存在互作時(shí)，CFP和YFP在空間上足夠接近而發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，YFP發(fā)射熒光，反之，則CFP發(fā)射熒光。

FRET技術(shù)在細(xì)胞生理研究、免疫分析和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用有許多成功的報(bào)道。曹薇薇等[39]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)FRET技術(shù)在活細(xì)胞生理狀態(tài)下，可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)TGF-β1/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過(guò)程;Mizutani等[40]首次將依據(jù)FRET原理設(shè)計(jì)的可檢測(cè)BCR-ABL激酶活性的基因編碼生物傳感器應(yīng)用于臨床;FRET技術(shù)也陸續(xù)用于一些腫瘤藥物的研發(fā)，如胰腺癌[41]、乳腺癌[42]等的抗癌藥物。FRET技術(shù)具有分析速度快、方法靈敏度高、選擇性好、無(wú)污染或污染小等優(yōu)點(diǎn)，使其在包括細(xì)胞生理研究和蛋白質(zhì)組學(xué)研究及臨床相關(guān)的藥物分析等領(lǐng)域應(yīng)用日益廣泛[43-46]。

1.5? GST Pull-down技術(shù)

1988年，Smith等[47]利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S Transferase，GST）融合標(biāo)簽從細(xì)菌中進(jìn)一步純化出GST融合蛋白質(zhì)。GST Pull-down是一個(gè)行之有效的體外驗(yàn)證PPI關(guān)系的試驗(yàn)技術(shù)，其既可以驗(yàn)證已知蛋白質(zhì)的相互作用，還可以篩選與已知蛋白質(zhì)互作的未知蛋白質(zhì)，現(xiàn)已經(jīng)廣泛用于分子生物學(xué)領(lǐng)域[48]。

GST Pull-down的原理是通過(guò)利用基因工程技術(shù)將目的蛋白質(zhì)基因與GST基因融合表達(dá)產(chǎn)生誘餌蛋白質(zhì)，將該誘餌蛋白質(zhì)溶液通過(guò)帶有GTH（Glutathione）的層析柱，誘餌蛋白質(zhì)與GTH結(jié)合，然后將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液過(guò)柱使它們反應(yīng)，再用洗脫液洗脫，如果目的蛋白質(zhì)與待測(cè)蛋白質(zhì)間不存在互作，則開(kāi)始時(shí)便被清洗出來(lái)，反之，則用洗脫液才能得到待測(cè)蛋白質(zhì)。GST Pull-down的應(yīng)用范圍也很廣泛。朱彤等[49]通過(guò)GST Pull-down驗(yàn)證植物體內(nèi)NRP（具有響應(yīng)脅迫并會(huì)引起細(xì)胞凋亡的一個(gè)蛋白質(zhì)）與Fy PP3（一種PP6型的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶）之間具有相互作用。Luo等[50]對(duì)GST Pull-down技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，使該技術(shù)的應(yīng)用更加簡(jiǎn)便快捷。GST Pull-down技術(shù)與其他蛋白質(zhì)互作技術(shù)的結(jié)合使用，試驗(yàn)結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確可信，Tran等[51]運(yùn)用GST Pull-down技術(shù)、雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析法完成了DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的鑒定。

GST Pull-down技術(shù)方法簡(jiǎn)單易行、操作方便。缺點(diǎn)是無(wú)法大規(guī)模篩選蛋白質(zhì)間的相互作用，且有些內(nèi)源性蛋白質(zhì)會(huì)干擾試驗(yàn)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。相信在未來(lái)GST Pull-down技術(shù)與其他PPI技術(shù)的聯(lián)合使用驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用將會(huì)發(fā)揮更大的作用。

1.6? 免疫共沉淀技術(shù)

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種研究特定蛋白質(zhì)之間相互作用的理想方法，其可以確定活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用。該方法依靠抗原與抗體特異性結(jié)合原理鑒定蛋白質(zhì)間的相互作用。

Co-IP技術(shù)的原理是細(xì)胞在溫和、非變性條件下裂解時(shí)，細(xì)胞內(nèi)許多完整的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用保留了下來(lái)，隨后加入與目標(biāo)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的抗體使之發(fā)生免疫共沉淀反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物沉淀，然后通過(guò)電泳分離、質(zhì)譜鑒定，再對(duì)這些蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行分析，以確定新的結(jié)合性伙伴、結(jié)合親和力、結(jié)合動(dòng)力學(xué)和目標(biāo)蛋白質(zhì)的功能。該技術(shù)既可以用來(lái)確定胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可以用于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)互作而形成的復(fù)合物。

目前，Co-IP技術(shù)在蛋白質(zhì)互作方面的應(yīng)用有了很大的發(fā)展。楊亮等[52]利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證SET與eEF1A1在人肝細(xì)胞內(nèi)的相互作用;Skieterska等[53]利用Co-IP技術(shù)鑒定了GPCR的二聚化作用;孫婷婷等[54]利用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析方法，在人肝癌細(xì)胞系細(xì)胞株HepG2內(nèi)篩選與肝細(xì)胞核因子（HNF）3β相互作用的蛋白質(zhì)。Co-IP技術(shù)與其他PPI技術(shù)（如GST-Pull down、酵母雙雜交系統(tǒng)等）相比具有其特有的優(yōu)勢(shì)，它可以鑒定活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間的自然結(jié)合，規(guī)避了外界因素，因此鑒定的蛋白質(zhì)可信度高。Co-IP與其他PPI技術(shù)的聯(lián)合使用可以有效提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確率。Co-IP技術(shù)也存在一定的局限性，如對(duì)低親和力的蛋白質(zhì)互作檢測(cè)效率低、鑒定的蛋白質(zhì)之間可能不是直接的互作、靈敏度受目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度限制、抗體制備也比較復(fù)雜且昂貴等。

1.7? Far-western blotting

Far-western blotting是由Western blotting發(fā)展而來(lái)的研究PPI的一種技術(shù)。在Far-western中通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目的蛋白質(zhì)樣品，固定到硝酸纖維素膜上，然后利用非抗體蛋白質(zhì)來(lái)探測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)[55]。Far-western blotting的原理是將樣品蛋白質(zhì)用非變性PAGE膠分離，將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，封閉膜、洗膜，加入待測(cè)蛋白質(zhì)使其與膜上蛋白質(zhì)相互作用，然后加入帶有標(biāo)記（如HRP）的待測(cè)蛋白質(zhì)的抗體一同孵育，將膜和標(biāo)記（如HRP）的底物一起孵育進(jìn)行顯色，分析試驗(yàn)結(jié)果。

近幾年Far-western blotting技術(shù)得到不斷改進(jìn)完善，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用。蘇婧等[56]通過(guò)Far-western blotting從正常人肝組織中篩選出乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原PreS1結(jié)合蛋白質(zhì)，為HBV的感染致病機(jī)理的闡述提供了理論依據(jù);Li等[57]研究了在細(xì)菌黏附和侵入中起重要作用的層黏連蛋白質(zhì)（LN）和纖連蛋白質(zhì)（FN）間的相互作用。Machida等[58]使用GST標(biāo)記的SH2結(jié)構(gòu)域作為探針，檢測(cè)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)磷酸化過(guò)程中與SH2結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白質(zhì)分子。Far-western blotting的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度較高、假陽(yáng)性低，在蛋白質(zhì)組學(xué)中得到廣泛應(yīng)用;主要缺點(diǎn)是它至少需要一種一定量的純化蛋白質(zhì)，并且存在不可避免的非特異性合。

1.8? 細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)互作技術(shù)

細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)互作技術(shù)（Cytoskeleton-based Assay for Protein-Protein Interaction，CAPPI）是2017年由美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校柳波教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的一種依賴(lài)于細(xì)胞骨架而研究PPI的新方法[59]，是利用細(xì)胞骨架的直觀(guān)性，通過(guò)煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)建立的一種技術(shù)，用于活體細(xì)胞生理環(huán)境中蛋白質(zhì)互作的檢測(cè)。CAPPI技術(shù)操作簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的光學(xué)操作和計(jì)算過(guò)程，有望應(yīng)用于更多的蛋白質(zhì)類(lèi)型。CAPPI技術(shù)在未來(lái)還有廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域和提升空間，該技術(shù)的廣泛應(yīng)用及不斷優(yōu)化將有力地推動(dòng)PPI研究的進(jìn)展。

除上述介紹的一些蛋白質(zhì)互作技術(shù)之外，還有等離子表面共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片（Protein Chip）技術(shù)、串聯(lián)親和層析（Tandem Affinity Purification，TAP）技術(shù)、細(xì)胞內(nèi)共定位（Cellular Colocalization）技術(shù)等。

2? 生物信息學(xué)（Bioinformatics）在蛋白質(zhì)互作中的應(yīng)用

生物信息學(xué)是20世紀(jì)80年代末開(kāi)始，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）的啟動(dòng)而興起的一門(mén)新的學(xué)科[60]。此技術(shù)主要研究蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子[61]，是一門(mén)由生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、數(shù)學(xué)、信息科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科交叉產(chǎn)生的新興學(xué)科[62]，主要依賴(lài)于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)海量的生物信息進(jìn)行集中綜合、管理、儲(chǔ)存、分析和傳播，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)及軟件處理發(fā)布，方便人們進(jìn)行查詢(xún)使用。

隨著生物信息學(xué)的迅速興起，生物信息學(xué)技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究上的應(yīng)用也越來(lái)越深入。研究人員將國(guó)內(nèi)外的部分涉及蛋白質(zhì)互作和生物信息學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了整合[63，64]，生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)互作中應(yīng)用的生命科學(xué)研究探索取得了顯著成果。葛金濤等[65]利用生物信息學(xué)工具和方法對(duì)葡萄miR159家族成員進(jìn)行分析，來(lái)研究葡萄miR159基因家族在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用;李漢成等[66]檢測(cè)甲基苯丙胺依賴(lài)大鼠和健康大鼠血清外泌體中微小RNA（miR）-181a-5p的表達(dá)，并對(duì)miR-181a-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及相關(guān)生物信息學(xué)分析;路東曄等[67]對(duì)沙柳LAS基因RT-PCR技術(shù)成功克隆的SpsLAS基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明，沙柳LAS基因與番茄LS、擬南芥LAS等功能已確認(rèn)的LS亞家族基因同源性較高，氨基酸相似性達(dá)50%以上，說(shuō)明了LAS基因?qū)τ谀旧参飩?cè)生分生組織同樣有重要影響。

生物信息學(xué)主要特點(diǎn)是信息量大、數(shù)據(jù)更新快、內(nèi)容復(fù)雜、傳播途徑網(wǎng)絡(luò)化[68]。利用生物信息學(xué)探究PPI技術(shù)，實(shí)現(xiàn)信息共享，為今后更為全面、便捷﹑詳盡地探索生命科學(xué)奠定了一定的信息化基礎(chǔ)。

3? 展望

近年來(lái)PPI研究發(fā)展迅速，其應(yīng)用也愈加廣泛，如在基因治療中，可建立基因組蛋白質(zhì)連鎖圖，確定多肽類(lèi)藥物的作用靶點(diǎn)[69]，針對(duì)一些疾病的治療有了新的突破方向。當(dāng)前的PPI技術(shù)存在一些假陽(yáng)性干擾，對(duì)于正確認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)有一定影響，而且有些技術(shù)耗資大、耗時(shí)多、耗用人力大，對(duì)試驗(yàn)條件要求比較高，還不易得出準(zhǔn)確的結(jié)果。每種技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，有些可以?xún)?yōu)勢(shì)互補(bǔ)，因此可以多種技術(shù)結(jié)合，優(yōu)化體系，盡量減少干擾，進(jìn)一步提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。針對(duì)具體的應(yīng)用，優(yōu)化整合互補(bǔ)不同PPI技術(shù)對(duì)解決當(dāng)前存在的一些技術(shù)缺陷，進(jìn)一步完善優(yōu)化PPI技術(shù)具有很重要的意義。

結(jié)合生物信息學(xué)的優(yōu)勢(shì)進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)、建模等分析，同時(shí)輔助有效的蛋白質(zhì)互作技術(shù)可以提高效率，節(jié)約成本，為蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展貢獻(xiàn)力量。

參考文獻(xiàn)：

[1] WU B，LI Z Y，YANG S C，et al. Regulation of apoptosis signaling pathway by common heat shock proteins[J].Chin J Biochem Mol Biol，2011，27（1）：22-31.

[2] YANG X X，WANG K，CHEN X J，et al. Function and regulation of MAVS，the mitochondrial antiviral signaling protein in innate immunity[J].Prog Biochem Biophys，2013，40（5）：397-405.

[3] RUDOLPH R，LILIE H. In vitro folding of inclusion body proteins[J].FASEB J，1996，10（1）：49-56.

[4] MITRA K，F(xiàn)RANK J. Ribosome dynamics：Insights from atomic structure modeling into cryo-electron microscopy maps[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct，2006，35（1）：299-317.

[5] CHAPMAN E，F(xiàn)ARR G W，USAITE R，et al. Global aggregation of newly translated proteins in an Escherichia coli strain deficient of the chaperonin GroEL[J].Proc Natl Acad Sci，2006，103（43）：15800-15805.

[6] CHEVALIER D，WALKER J C. Functional genomics of protein kinases in plants[J].Brief Funct Genomic Proteomic，2005，3（4）：362-371.

[7] DHAR-CHOWDHURY P，HARRELL M D，HAN S Y，et al. The glycolytic enzymes，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，triose-phosphate isomerase， and pyruvate kinase are components of the K（ATP） channel macromolecular complex and regulate its function[J].J Biol Chem，2005，280（46）：38464-38470.

[8] FIELDS S，SONG O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions[J].Nature，1989，340（6230）：245-256.

[9] KEEGAN L，GILL G，PTASHNE M. Separation of DNA bind from the transcription-activating function of eukaryotic regulatory protein[J].Science，1986，231（4739）：699-704.

[10] MA J，PTASHNE M. A new class of yeast transcriptional activators[J].Cell，1987，51（1）：113-119.

[11] FIELDS S，STERNGLANZ R. The two-hybrid system：An assay for protein-protein interactions[J].Trends Genet，1994，10（8）：286-292.

[12] 楊齊衡，李? 林.酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1999，31（3）：221-225.

[13] 李明智，趙金會(huì)，劉勛成，等.利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選水稻組蛋白去乙?；窰DA705的互作蛋白[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2015，23（1）：43-50.

[14] SILVA J V，F(xiàn)REITAS M J，F(xiàn)ELGUEIRAS J，et al. The power of the yeast two-hybrid system in the identification of novel drug targets：Building and modulating PPP1 interactomes[J].Expert Rev Proteomics，2015，12（2）：147.

[15] 陳澤良，高? 婷，張部昌，等.應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與埃博拉病毒VP24、VP35、VP40蛋白相互作用的宿主蛋白[J].生物技術(shù)通訊，2016，27（3）：308-313.

[16] 俞孔堅(jiān)，李迪華.《景觀(guān)設(shè)計(jì)：專(zhuān)業(yè)學(xué)科與教育》導(dǎo)讀[J].中國(guó)園林，2004， 20（5）：7-8.

[17] KOEGL M，UETZ P. Improving yeast two-hybrid screening systems[J].Brief Funct Genomic Proteomic，2007，6（4）：302-312.

[18] 趙? 靜，王宏偉，田二杰，等.蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及其應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（1）：116-120.

[19] HU C D，CHINENOV Y，KERPPOLA T K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation[J].Mol Cell，2002，9（4）：789-798.

[20] GHOSH I，HAMILTON A D，REGAN L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly：Application to the green fluorescent protein[J].Am Chem Soc，2000，122：5658-5659.

[21] 曹建美.雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BiFC）分析玉米MAPK5與bZIP72蛋白的相互作用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（14）：152-154，161.

[22] 劉文曉，閆朝君，宋質(zhì)銀.雙分子熒光互補(bǔ)法（BiFC）精確MICOS復(fù)合物精細(xì)結(jié)構(gòu)[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，44（4）：690-694.

[23] CHEN M H，LI W，ZHANG Z，et al. Novel near-infrared BiFC systems from a bacterial phytoch rome for imaging protein interactions and drug evaluation under physiological conditions[J].Biomaterials，2015，48：97-107.

[24] NAGAI T，SAWANO A，PARK E S，et al. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+[J].Proc Natl Acad Sci，2001，98（6）：3197-202.

[25] MATZ M V，F(xiàn)RADKOV A F，LABAS Y A，et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species[J].Nat Biotechnol，1999，17（10）：969-973.

[26] KERPPOLA T K. Bimolecular fluorescence complementation （BiFC） analysis as a probe of protein interactions in living cells[J].Annu Rev Biophys，2008，37（37）：465-487.

[27] KERPPOLA T K. Visualization of molecular interactions using bimolecular fluorescence complementation analysis：Characteristics of protein fragment complementation[J].Chem Soc Rev，2009，40（50）：2876-2886.

[28] SMITH G P. Filamentous fusion phage：Novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J].Science，1985，228（4705）：1315-1317.

[29] EBRAHIMIZADEH W，RAJABIBAZL M. Bacteriophage vehicles for phage display：Biology mechanism and application[J].Curr Microbiol，2014，69（2）：109-120.

[30] MEHR K S，MOUSAVI S L，RASOOLI I，et al.A DNA vaccine against Escherichia coli O157：H7[J].Iran Biomed J，2012，16（3）：133-139.

[31] WANG L F，YU M. Epitope identification and discovery using phage display libraries：Applications in vaccine development and diagnostics[J].Curr Drug Target，2004，5（1）：1-15.

[32] 高凱麗，李維娜，薛曉暢，等.T7噬菌體展示人肝癌cDNA文庫(kù)篩選人CD8～+T淋巴細(xì)胞特異結(jié)合分子[J].生物技術(shù)通訊，2017， 28（3）：333-337.

[33] KUHN P，F(xiàn)UHNER V，UNKAUF T，et al. Recombinant antibodies for diagnostics and therapy against pathogens and toxins generated by phage display[J].Proteomics clinical applications， 2016，10（9-10）：922-948.

[34] 唐? 瑞，楊勇波.噬菌體展示技術(shù)篩選人腸道病毒71型3A蛋白相互作用蛋白[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，35（16）：2129-2131.

[35] ALBAN S M，DE MOURA J F，THOMAZ-SOCCOL V，et al. Phage display and synthetic peptides as promising biotechnological tools for the serological diagnosis of leprosy[J].PLoS One，2014，9（8）：e106222.

[36] F？魻RSTER T. Intramolecular energy migration and fluorescence[J].Ann Phys，1948，2：55-75.

[37] PRASHER D C，ECKENRODE V K，WARD W W，et al. Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein[J].Gene，1992，111（2）：229-233.

[38] GHISAIDOOBE A B，CHUNG S J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins：A focus on F？觟rster resonance energy transfer techniques[J].Int J Mol Sci，2014，15（12）：22518-22538.

[39] 曹薇薇，劉? 偉，王維山，等.利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)研究TGF-β/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2014， 31（5）：1080-1084.

[40] MIZUTANI T，KONDO T，DARMANIN S，et al. A novel FRET-based biosensor for the measurement of BCR-ABL activity and its response to drugs in living cell[J].Clin Cancer Res，2010，16（15）：3964-3975.

[41] NOBIS M，MCGHEE E J，MORTON J P，et al. Intravital FLIM-FRET imaging reveals dasatinib-induced spatial control of src inpancreatic cancer[J].Cancer Res，2013，73（15）：4674-4686.

[42] KUMAGAI Y，NAOKI H，NAKASYO E，et al. Heterogeneity in ERK activity as visualized by in vivo FRET imaging of mammary tumor cells developed in MMTV-Neu mice[J].Oncogene，2015，34（8）：1051-1057.

[43] WABUYELE M B，F(xiàn)ARQUAR H，STRYJEWSKI W，et al. Approaching real-time molecular diagnostics：Single-pair fluorescence resonance energy transfer（spFRET） detection for the analysis of low abundant point mutations in K-ras oncogenes[J].Journal of the american chemical society，2003，125（23）：6937-6945.

[44] CHRISTIAN T D，ROMANO L. Monitoring the conformation of benzo[a]pyrene adducts in the polymerase active site using fluorescence resonance energy transfer[J].Biochemistry，2009， 48（23）：5382-5388.

[45] DAI Y，YANG D，MA P，et al. Doxorubicin conjugated NaYF（4）：Yb（3+）/Tm（3+） nanoparticles for therapy and sensing of drug delivery by luminescence resonance energy transfer[J].Biomaterials，2012，33（33）：8704-8713.

[46] SAVLA R，TARATULA O，GARBUZENKO O，et al. Tumor targeted quantum dot-mucin 1 aptamer-doxorubicin conjugate for imaging and treatment of cancer[J].Journal of controlled releease，2011，153（1）：16-22.

[47] SMITH D B，JOHNSON K S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase[J].Gene，1988，67（1）：31-40.

[48] WISSMUELLER S，F(xiàn)ONT J，LIEW C W，et al. Protein-protein interactions：Analysis of a false positive GST pulldown result[J].Proteins：strcture，function bioinformatics，2011，79（8）：2365-2371.

[49] 朱? 彤，龔清秋，劉新奇.擬南芥富天冬酰胺蛋白NRP與PP6型磷酸酶FyPP3具有相互作用[J].南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，50（2）：102-107.

[50] LUO L，KING N P，YEO J C，et al. Single-step protease cleavage elution for identification of protein-protein interactions from GST pull-down and mass spectrometry[J].Protemics，2014，14（1）：19-23.

[51] TRAN D H，SHISHIDO Y，CHUNG S P，et al. Identification of DNA-binding proteins that interact with the 5′-flanking region of the human D-amino acid oxidase gene by pull-down assay coupled with two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2015，116：94-100.

[52] 楊? 亮，楊細(xì)飛，張? 毅，等.利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證SET與eEF1A1在人肝細(xì)胞內(nèi)的相互作用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010， 38（35）：19946-19948.

[53] SKIETERSKA K，DUCHOU J，LINTERMANS B，et al. Chapter 17-detection of G protein-coupled receptor （GPCR） dimerization by coimmunoprecipitation[J].Methods Cell Biol，2013，117：323-340.

[54] 孫婷婷，宋麗娜，于? 淼，等.免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜對(duì)肝細(xì)胞核因子3β蛋白復(fù)合體的分離鑒定[J].生物技術(shù)通訊，2011，22（5）：662-666.

[55] EDMONDSON D G，DENT S Y. Identifi cation of protein interactions by far western analysis[J].Curr Protoc Protein Sci，2001，2：1-10.

[56] 蘇? 婧，楊? 靜，張? 松，等.用Far-Western印跡技術(shù)篩選人肝組織中與乙肝病毒表面抗原PreS1相互作用的蛋白[J].生物技術(shù)通訊，2010，21（3）：355-358.

[57] LI Q，LIU H，DU D，et al. Identification of novel laminin-and fibronectin-binding proteins by Far-Western blot：Capturing the adhesins of Streptococcus suis Type 2[J].Frontiers in cellular & infection microbiology，2015，5：82.

[58] MACHIDA K，MAYER B J. Detection of protein-protein interactions by far-western blotting[J].Methods Mol Biol，2009， 536：313-329.

[59] LV S，MIAO H，LUO M，et al. CAPPI：A Cytoskeleton-based localization assay reports protein-protein interaction in living cells by fluorescence microscopy[J].Molecular plant，2017，10（11）：1473-1476.

[60] 吳? 旻.生物信息學(xué)的發(fā)展[J].中國(guó)科學(xué)院院刊，1998，13（3）：183-186.

[61] 張? 鳳.蛋白質(zhì)組學(xué)核心技術(shù)研究綜述[J].延安職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014（5）：137-139.

[62] 姜? 鑫.生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及其利用方法[J].現(xiàn)代情報(bào)，2005， 25（6）：185-187.

[63] 凌夢(mèng)婷，宮君原，李君武，等.LTQ-FT-MS技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)篩選與HBV Polymerase存在潛在相互作用的宿主蛋白[J].病毒學(xué)報(bào)，2014，30（6）：636-644.

[64] YAU Y H，SHOCHAT S G. Analysis of affinity of dengue virus protein interaction using biacore[J].Methods in molecular biology，2014，1138：271-284.

[65] 葛金濤，王麗麗，趙統(tǒng)利，等.葡萄miR159家族生物信息學(xué)分析及靶基因預(yù)測(cè)分析[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，30（2）：21-25.

[66] 李漢成，李? 嬋，周玉婷，等.微小RNA-181a-5p在甲基苯丙胺依賴(lài)大鼠血清外泌體中的表達(dá)及生物信息學(xué)分析[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2018（1）：45-48.

[67] 路東曄，賀玉嬌，金? 娜，等.沙柳SpsLAS基因克隆及生物信息學(xué)分析[J].分子植物育種，2017，15（2）：483-491.

[68] SIRDESHMUKH R. Indian proteomics efforts and human proteome project[J].J Proteomics，2015，18（3）：1-5.

[69] YU Z H，GE Y Y，XIE L，et al. Using a yeast two-hybrid system to identify FTCD as a new regulator for HIF-1α in HepG2 cells[J].Cell signal，2014，26（7）：1560-1566.

收稿日期：2019-01-20

作者簡(jiǎn)介：盧艷艷（1991-），女，山東聊城人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槟Ｊ街参锛?xì)胞蛋白互作，（電話(huà)）17852267227（電子信箱）