徐丹丹 趙邯鄲 王秀然 關(guān)淑艷

摘要：從富含有機(jī)質(zhì)的環(huán)境中采集土樣，通過(guò)植酸鈣平板透明圈法初篩得到產(chǎn)植酸酶菌株，進(jìn)而用釩-鉬酸銨法和丙酮-磷鉬酸銨法2種方法測(cè)定植酸酶酶活力，并進(jìn)行比較。結(jié)果表明，釩-鉬酸銨法為準(zhǔn)確、可用的方法，通過(guò)正交試驗(yàn)確定了最適產(chǎn)酶發(fā)酵條件為pH 5，可溶性淀粉用量1.25 g/100 mL，酵母粉用量1.80 g/100 mL，植酸鈣用量1.0 g/100 mL。

關(guān)鍵詞：植酸酶;酶活;測(cè)定;釩-鉬酸銨法;丙酮-磷鉬酸銨法

中圖分類號(hào)：Q93-332? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）12-0134-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.031? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： The soil sample was collected from the organic-rich environment， and phytase production strains were obtained by preliminary screening with calcium phytate plate transparent ring method. Then phytase activity was determined by two different methods vanadium-ammonium molybdate method and acetone-ammonium phosphomolybdate method， and then compared. The results showed that the method of vanadium-ammonium molybdate was accurate and available. The orthogonal fermentation test determines that pH is 5， the yield of soluble enzyme is 1.25 g/100 mL， the optimum dosage of yeast powder is 1.80 g/100 mL， and the amount of calcium phytate is 1.0 g/100 mL.

Key words： phytase; enzyme activity; measure; vanadium-ammonium molybdate method; acetone-ammonium phosphomolybdate method

植酸（肌醇六磷酸）及植酸鹽廣泛存在于植物體中，是植物磷的主要貯存形式，占植物中總磷的60%～80%[1]。但植酸磷難以被單胃動(dòng)物吸收利用，隨糞便排出體外會(huì)造成水體和土壤的嚴(yán)重磷污染[2]。同時(shí)，植酸及其鹽還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，能與多種金屬離子螯合并能與蛋白質(zhì)等形成難溶的復(fù)合物，影響動(dòng)物對(duì)礦質(zhì)元素和蛋白質(zhì)的吸收利用[3，4]。植酸酶能將植酸及其鹽類降解為肌醇和磷酸（或磷酸鹽），作為飼料添加劑可以提高植酸磷的利用率，提高植物性飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，減少畜禽糞便中磷的排放，減輕環(huán)境污染[5-7]。傳統(tǒng)的產(chǎn)植酸酶菌株的篩選方法為透明圈法，該方法利用微生物在植酸酶篩選培養(yǎng)基上降解植酸鈣，在菌落周圍生成透明圈來(lái)初步判斷微生物是否產(chǎn)植酸酶，但有些產(chǎn)酸菌株也能降解植酸鈣產(chǎn)生透明圈，故平板透明圈法缺乏特異性和絕對(duì)性，必須再對(duì)產(chǎn)透明圈的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液的植酸酶活性，才能判斷出該菌株是否能夠產(chǎn)植酸酶。植酸酶活性的測(cè)定方法較多，有釩-鉬酸銨法、硫酸亞鐵-鉬藍(lán)法、丙酮-磷鉬酸銨法、微板法和微量比色法等[8]。本研究從土壤中粗篩出產(chǎn)植酸酶的菌株，通過(guò)釩-鉬酸銨法和丙酮-磷鉬酸銨法2種方法測(cè)定酶活力，確定最適宜本試驗(yàn)菌株的酶活測(cè)定方法，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 菌株

試驗(yàn)菌株為前期實(shí)驗(yàn)室所篩產(chǎn)植酸酶菌株。

1.2? 主要試劑

植酸鈉（P8810，Sigma公司）;植酸鈣（阿拉丁試劑）;其余試劑均為分析純。

1.2.1? 丙酮-磷鉬酸銨法? 丙酮-磷鉬酸銨法測(cè)定酶活所需試劑如表1所示。

1.2.2? 釩-鉬酸銨法? 釩-鉬酸銨法測(cè)定酶活所需試劑如表2所示。

1.3? 主要設(shè)備

721型分光光度計(jì)，PHS-3TC型精密數(shù)顯酸度計(jì)，離心機(jī)。

1.4? 方法

1.4.1? 粗酶液的獲得? 將實(shí)驗(yàn)室前期篩選的植酸酶菌株用馬丁斜面進(jìn)行活化，再?gòu)幕罨泵嫒℃咦咏尤?瓶盛有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，置于26 ℃、150 r/min搖床發(fā)酵4 d，過(guò)濾離心獲得發(fā)酵上清液。

1.4.2? 發(fā)酵條件的研究? 實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)篩選出最適碳源為可溶性淀粉，氮源為酵母粉。對(duì)二者用量進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，以確定最佳碳氮源以及植酸鈣用量，同時(shí)選出產(chǎn)酶最適的pH，發(fā)酵獲得的粗酶液分別用2種方法進(jìn)行酶活測(cè)定。

1）可溶性淀粉用量。將淀粉按0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g/100 mL添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，確定其最佳用量。

2）酵母粉用量。將酵母粉按1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 g/100 mL添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，確定其最佳用量。

3）植酸鈣用量。調(diào)整培養(yǎng)基中植酸鈣的用量，在培養(yǎng)基中分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/100 mL，測(cè)定酶活，以確定植酸鈣的最佳用量。

4）初始pH篩選。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，使其分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，測(cè)定酶活，以確定產(chǎn)酶最適初始pH。

1.4.3? 丙酮-磷鉬酸銨法測(cè)定不同發(fā)酵條件下植酸酶酶活

1）磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。配制濃度分別為0.9、1.2、1.8、2.4、3.0 mmoL/L的磷酸二氫鉀溶液，各吸取2 mL，再加入顯色液AAP 8 mL，搖勻顯色5 min，加入1.0 mL檸檬酸溶液，混勻后在415 nm處比色測(cè)定，繪制磷濃度與吸光度的關(guān)系曲線，以不加磷酸二氫鉀溶液而補(bǔ)加去離子水作為空白。

2）酶活測(cè)定。以每分鐘從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 nmol無(wú)機(jī)磷為一個(gè)酶活單位（U），稀釋發(fā)酵液到酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，吸取酶液0.5 mL，加入植酸鈉溶液0.5 mL。37 ℃水浴60 min，然后加入顯色液AAP 8 mL，搖勻顯色5 min，加入1.0 mL檸檬酸溶液，以檸檬酸滅活的稀釋酶液相同處理作為對(duì)照在415 nm處比色測(cè)定。

式中，P為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的反應(yīng)液中總磷的濃度;P0為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的反應(yīng)液中本底磷的濃度;20為分析酶液時(shí)的總稀釋倍數(shù);n為稀釋酶液的總稀釋倍數(shù);t為酶反應(yīng)時(shí)間。

1.4.4? 釩-鉬酸銨法測(cè)定不同發(fā)酵條件下植酸酶酶活

1）磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。將磷酸二氫鉀母液按照梯度進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)為2、4、8、16、32倍，溶液濃度分別為25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5 mol/L，在415 nn波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，無(wú)機(jī)磷濃度為橫坐標(biāo)，列出直線回歸方程。

2）酶活測(cè)定方法。以每分鐘從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 nmol無(wú)機(jī)磷為1個(gè)酶活單位（U）。取10 mL試管進(jìn)行操作。首先將0.9 mL乙酸緩沖液與0.2 mL待反應(yīng)液混合，水浴鍋37 ℃預(yù)熱5 min，然后加入2 mL植酸鈉，混勻后水浴鍋37 ℃水解30 min，最后加入2 mL終止液。反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10 min，如出現(xiàn)混濁需在離心機(jī)上4 000 r/min離心10 min，取上清液以標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零，在分光光度計(jì)415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度，根據(jù)公式計(jì)算酶活。

式中，U為試樣中植酸酶的活性（U/mL）;c為根據(jù)實(shí)際樣液的吸光度由直線回歸方程計(jì)算出的y值;F為試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù);v為試樣反應(yīng)體積（mL）;30為反應(yīng)時(shí)間（min）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同方法測(cè)定酶活磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1? 丙酮-磷鉬酸銨法磷標(biāo)準(zhǔn)曲線? 按照“1.4.3”的方法制作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，以磷濃度為橫坐標(biāo)，OD415 nm的值為縱坐標(biāo)繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

2.1.2? 釩-鉬酸銨法磷標(biāo)準(zhǔn)曲線? 按照“1.4.4”的方法制作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度為縱坐標(biāo)，無(wú)機(jī)磷濃度為橫坐標(biāo)，結(jié)果如圖2所示。

2.2? 不同方法測(cè)定不同發(fā)酵條件下植酸酶酶活

2.2.1? 可溶性淀粉最佳用量篩選? 將加入不同量淀粉的培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，用2種方法測(cè)定植酸酶酶活，兩者之間的差異很小，確定出其最佳用量為1.25 g/100 mL，結(jié)果如圖3所示。

2.2.2? 酵母粉最佳用量篩選? 將加入不同用量酵母粉的培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，用2種方法測(cè)定植酸酶酶活，所得酶活變化趨勢(shì)相同，確定酵母粉最佳用量為1.80 g/100 mL，結(jié)果如圖4所示。

2.2.3? 植酸鈣最佳用量篩選? 由圖5可知，對(duì)加入不同植酸鈣的培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，用2種方法測(cè)定植酸酶酶活，兩者之間的差異很小，確定植酸鈣的最佳用量為1.0 g/100 mL。

2.2.4? 不同初始pH的篩選? 改變培養(yǎng)基中pH，用2種發(fā)法測(cè)定粗酶液酶活力，丙酮-磷鉬酸銨法雖然測(cè)出了植酸酶的酶活，但均值在60 U/mL左右，沒(méi)有顯示出酶活差異，出現(xiàn)較大誤差;通過(guò)釩-鉬酸銨法測(cè)定植酸酶的酶活，可以看出植酸酶酶活最佳pH為5，結(jié)果如圖6所示。

2.3? 正交試驗(yàn)

將所選的最佳碳氮源淀粉用量、酵母粉用量、初始pH及植酸鈣用量進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，確定出最佳的培養(yǎng)基成分。由表3可知，影響植酸酶酶活的主次因素為植酸鈣用量（A）>可溶性淀粉用量? ?（B）>pH（C）>酵母粉用量（B），其最佳組合方案為A2B2C2D2，即100 mL液體培養(yǎng)基中含有1.25 g淀粉、1.80 g酵母粉、pH 5、植酸鈣1.0 g。

3? 小結(jié)

通過(guò)搖菌獲得植酸酶粗酶液，通過(guò)2種方法對(duì)其進(jìn)行酶活檢測(cè)，并進(jìn)而進(jìn)行發(fā)酵條件的研究，確定出最佳培養(yǎng)基組成。釩-鉬酸銨法被確定為本試驗(yàn)最適宜的酶活檢測(cè)方法?，F(xiàn)在測(cè)定植酸酶酶活的方法在逐漸改進(jìn)，但是也沒(méi)有明確的指定測(cè)定方法，本試驗(yàn)采用2種方法測(cè)定植酸酶酶活，出現(xiàn)了較大差異，其原因正在進(jìn)一步驗(yàn)證中。因本次篩選的植酸酶菌株可能為一種新的菌種，其生理生化規(guī)律有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2019-01-15

作者簡(jiǎn)介：徐丹丹（1989-），女，吉林德惠人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹匾r(nóng)藝性狀基因的分離功能鑒定及品種改良，