朱磊　胡婷　劉德明　向昌國

摘要：以華靈高科筍都四季滿身紅蘿卜為試驗(yàn)材料，采用盆栽試驗(yàn)，設(shè)置6個(gè)施硒組分（0、0.5、2.5、10.0、20.0、40.0 mg/L）分別在葉旺盛生長期、塊根膨大期、成熟期葉面噴施亞硒酸鈉，研究葉面施硒濃度對(duì)蘿卜生長、硒吸收和轉(zhuǎn)化、硒形態(tài)分布以及對(duì)蘿卜抗氧化能力的影響。結(jié)果表明，2.5 mg/L硒處理提高了蘿卜果實(shí)產(chǎn)量，40.0 mg/L硒處理對(duì)蘿卜果實(shí)生長具有抑制作用。隨著葉面施硒濃度增加，蘿卜葉子和果實(shí)中硒含量顯著增加，且含量最高分別達(dá)到637、0.63 mg/kg。硒在蘿卜葉子中主要以硒代蛋氨酸（SeMet）形式存在，含量為1.51 mg/kg;蘿卜果實(shí)中硒主要以硒代胱氨酸（SeCys2）存在，含量為0.29 mg/kg。與對(duì)照組相比，2.5 mg/L處理組谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性增加了106.26%（P<0.05），過氧化物酶（POD）活性增加了14.87%（P<0.05），超氧化物歧化酶（SOD）活性無顯著變化。適宜濃度的外源施硒能夠增加蘿卜產(chǎn)量、提高蘿卜硒含量和增強(qiáng)抗氧化能力。因此，葉面施硒濃度2.5 mg/L為蘿卜最佳施用量。

關(guān)鍵詞：亞硒酸鈉;蘿卜;硒形態(tài);抗氧化能力;葉面噴施

中圖分類號(hào)： S631.106? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0127-05

硒是人體所必需的微量元素之一[1]，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)人體免疫力和拮抗重金屬等生理功能[2-4]。人體缺硒會(huì)導(dǎo)致多發(fā)性硬化癥、肌肉萎縮癥、心臟病、免疫系統(tǒng)受損、癌癥和生殖系統(tǒng)疾病等[5]。全球約有29個(gè)國家存在缺硒現(xiàn)象[6]，我國有約72%的地區(qū)屬于缺硒地區(qū)，約7億人口有著不同程度的硒攝入量不足的情況[7]。中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)規(guī)定成年人膳食硒攝入量最少為40 μg/d，可耐受最大量為 400 μg/d[8]。

硒不是高等植物所必需的微量元素，但適宜濃度的硒能促進(jìn)植物生長[9]。適宜濃度的外源施硒能夠促進(jìn)十字花科植物生長，提高產(chǎn)量，硒濃度過高會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，抑制植物生長[10-12]。這可能是適宜濃度補(bǔ)硒增加了植物對(duì)硫元素的的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化活性，減少了脂質(zhì)過氧化和食草性昆蟲對(duì)植物的迫害[13-15]。硒對(duì)植物的毒域范圍取決于物種和環(huán)境，影響植物吸收硒能力的主要因素是基因遺傳其次是非生物因素，如環(huán)境條件（微生物群落）和硫、氮等元素之間的相互作用[16]。硒能夠參與合成硒代半胱氨酸且是一些硒蛋白酶的活性中心[17]。谷胱甘肽過氧化物酶能夠通過降低過氧化氫、有機(jī)氫過氧化物、磷脂有機(jī)過氧化物含量來增強(qiáng)植物抗氧化能力[18]。研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度外源硒能夠提高植物谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性從而增強(qiáng)植物的抗氧化能力，防止細(xì)胞氧化損傷[19-21]。

近年來，以植物為基料作為富硒源是一種較為安全的補(bǔ)硒方式，植物通過吸收和轉(zhuǎn)化將無機(jī)硒轉(zhuǎn)為人體能夠吸收的安全有效的有機(jī)硒，從而滿足人體日常膳食需求。有研究表明，富硒土壤地區(qū)生長的植物未達(dá)到富硒標(biāo)準(zhǔn)可能是土壤本底重金屬含量過高拮抗硒的吸收、土壤中硒活化率較低、不同物種對(duì)硒的吸收能力差異等因素造成的[22-24]。蔬菜是人類日常膳食最常見的食物，其中十字花科類的蔬菜具有較強(qiáng)的富硒能力，如芥菜、小白菜、蘿卜等。蘿卜（Raphanus sativus L.）屬一、二年生蔬菜作物，南北方皆可栽培，為重要的經(jīng)濟(jì)作物，葉果皆可食用。以蔬菜作為人類補(bǔ)硒來源，研究其對(duì)硒的吸收轉(zhuǎn)化和抗氧化能力，具有非常大的科學(xué)意義。

基于植物在天然富硒地區(qū)對(duì)硒的吸收效率較低的現(xiàn)象，本研究通過葉面噴施硒來干預(yù)富硒地區(qū)植物對(duì)硒吸收及利用效率，揭示葉面施硒對(duì)蘿卜根際根圍土壤中硒的動(dòng)態(tài)分布的影響以及硒對(duì)蘿卜生長、硒吸收與轉(zhuǎn)化及抗氧化能力的影響。本試驗(yàn)通過對(duì)蘿卜葉面噴施不同濃度梯度的亞硒酸鈉的方式，探究外源施硒對(duì)蘿卜生長、硒吸收轉(zhuǎn)化和抗氧化能力的影響，從而確定最佳葉面施硒濃度，為富硒蘿卜生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為盆栽蘿卜（Raphanus sativus L.），品種為華靈高科筍都四季滿身紅。盆栽土壤采自湖南省張家界市永定區(qū)富硒地區(qū)[25]，土壤本底全硒含量為1.67 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)于2017年10月至2018年1月在張家界市永定區(qū)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，分別為0、0.5、2.5、10.0、20.0、40.0 mg/L，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)。盆栽試驗(yàn)采用上口內(nèi)徑為29 cm，下口內(nèi)徑為19 cm，高為23 cm的不透光圓柱形塑料花盆，每盆裝土10 kg，定苗為4株。分別在蘿卜（葉旺盛生長期、塊根膨大期、成熟期）葉面正反共噴3次亞硒酸鈉溶液，間隔時(shí)間為10 d，每次每盆噴施 10 mL，以噴純水為對(duì)照組，選陰天或晴天16：00后施硒。2018年1月18日蘿卜成熟，共培養(yǎng)90 d，每盆選擇2株代表性植株，整株收獲。用蒸餾水清洗干凈，拍照記錄，以葉子和果實(shí)來檢測(cè)蘿卜總硒含量、硒形態(tài)和抗氧化能力。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 蘿卜總硒含量測(cè)定 參照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 5009.93—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》）將采集到的蘿卜葉子和果實(shí)先用自來水充分洗凈后，再用超純水反復(fù)沖洗干凈，放入70 ℃烘箱中烘干，粉碎后過60目篩制成樣品，精確稱取0.200 0 g，加6 mL硝酸冷浸過夜，加2 mL H2O2，電熱板上消解至澄清，再加3 mL 6 mol/L鹽酸消解0.5 h。冷卻后從電熱板取下，定容至25 mL容量瓶，利用SA-10氫化物發(fā)生-原子熒光法測(cè)定[26]。

1.3.2 土壤總硒含量測(cè)定 參照（NY/T 1104—2006《土壤中全硒的測(cè)定》）將蘿卜盆栽所用土壤放入70 ℃烘箱中烘干，粉碎后過60 目篩制成樣品，精確稱取0.200 0 g，加5 mL硝酸冷浸過夜，再加 5 mL 高氯酸，電熱板上消解至澄清，再加3 mL 6 mol/L鹽酸消解0.5 h。冷卻后從電熱板取下，定容至25 mL容量瓶，利用SA-10氫化物發(fā)生-原子熒光法測(cè)定。

1.3.3 硒形態(tài)測(cè)定 參照文獻(xiàn)[27-28]將冷凍干燥后的蘿卜鮮樣粉碎，過60目篩，取0.500 0 g于離心管中，稱取8 mg鏈霉蛋白酶E溶于10 mL水，加入到離心管中，混勻，37 ℃恒溫水浴振蕩提取24 h。上述提取完成，12 000 r/min離心 10 min，取上清液，過0.22 μm有機(jī)濾膜，再利用SA-10液相色譜-原子熒光形態(tài)分析儀（HPLC-HG-AFS）進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 抗氧化能力測(cè)定 稱取新鮮蘿卜葉3.000 0 g，在冰冷的生理鹽水中漂洗干凈，用濾紙擦干，在冰水浴中剪碎蘿卜葉子，放入研缽，配置30 mL 0.86%冷生理鹽水作為勻漿介質(zhì)，倒1/3于研缽使蘿卜葉子充分研碎，制成勻漿，再用剩余2/3冷生理鹽水沖洗殘留在研缽上的蘿卜勻漿，得到10%蘿卜葉子勻漿，在3 000 r/min離心15 min取上清液測(cè)定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，分別在412、420、550 nm波長條件下測(cè)定其吸光度，顯色過程和計(jì)算方法均參照南京建成試劑盒說明方法來進(jìn)行，以上3種抗氧化酶活性測(cè)定均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Excel 2010、Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，SAS 9.2 Duncans新負(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF）是元素轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)及在植株不同部位間轉(zhuǎn)移的效率。本研究以蘿卜果實(shí)和葉片硒含量的比值來表示轉(zhuǎn)移系數(shù)的大小。蘿卜硒轉(zhuǎn)移系數(shù)=蘿卜果實(shí)硒含量/蘿卜葉片硒含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)蘿卜生長發(fā)育的影響

葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)蘿卜生長的影響結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，0（對(duì)照組）、0.5、2.5 mg/L硒處理組的蘿卜葉色蔥綠，果實(shí)壯碩，長勢(shì)較好。而10.0、20.0、40.0 mg/L硒處理組蘿卜葉片微卷，且40.0 mg/L處理組果實(shí)矮小，切開果肉發(fā)紫，出現(xiàn)一定的病變癥狀。

葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)蘿卜生物量的影響如圖2所示，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，0.5、2.5 mg/L硒處理組果實(shí)生物量有一定的提高，分別增加了7.49%、7.61%;40.0 mg/L硒處理組果實(shí)的生物量降低了38.91%，但與對(duì)照差異不顯著。隨著葉面噴施亞硒酸鈉的濃度增加，蘿卜葉生物量無顯著變化，但蘿卜果實(shí)生物量呈降低趨勢(shì)，且40.0 mg/L處理組蘿卜果實(shí)生物量與0.5、2.5 mg/L硒處理組相比顯著降低。

2.2 葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)蘿卜總硒含量的影響

隨著葉面噴施硒濃度增加，蘿卜葉和果實(shí)中硒含量均呈明顯的增加趨勢(shì)（圖3）。蘿卜葉對(duì)硒的積累明顯高于果實(shí)，40.0 mg/L處理組葉子和果實(shí)中硒含量達(dá)到6.37、0.63 mg/kg，是對(duì)照組的蘿卜葉子硒含量的33.5倍和果實(shí)硒含量的7倍。不同施硒濃度處理間硒含量表現(xiàn)出明顯差異，其中0.5 mg/L處理組與對(duì)照組相比葉和果實(shí)中硒含量略有提升，但差異不顯著，2.5、10.0、20.0、40.0 mg/L處理組處理后蘿卜葉和果實(shí)硒含量顯著高于對(duì)照組分（P<0.05），其中40.0 mg/L處理組效果最為明顯，這說明隨著外源施硒濃度的增加，蘿卜葉和果實(shí)對(duì)硒的富集能力增強(qiáng)，葉面施硒能夠有效提高蘿卜葉、果實(shí)中硒含量，蘿卜對(duì)硒具有較好的吸收和富集能力。對(duì)照組和硒處理組中葉硒含量均高于果實(shí)，說明葉面施硒后蘿卜對(duì)硒的吸收轉(zhuǎn)化主要存在于葉中，只有部分轉(zhuǎn)運(yùn)至蘿卜果實(shí)。

如表1所示，隨著葉面噴施硒濃度的增加，蘿卜硒轉(zhuǎn)移系數(shù)呈下降趨勢(shì)，表明較低濃度的硒能夠高效地被植物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，但當(dāng)施硒濃度過高時(shí)植物對(duì)硒的轉(zhuǎn)運(yùn)率會(huì)降低。

2.3 葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)蘿卜盆栽土壤中硒轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

如圖4所示，葉面噴施亞硒酸鈉各處理中，除10.0 mg/L處理以外其他各處理間蘿卜生長根際土壤硒含量均無顯著差異。在10.0 mg/L硒處理?xiàng)l件下，根際土壤硒含量顯著降低，說明該濃度促進(jìn)根部生長，使得根部從土壤中硒吸收的能力增強(qiáng)。0.5、2.5、10.0 mg/L硒處理?xiàng)l件下根圍土壤硒含量顯著低于對(duì)照組。在2.5 mg/L硒處理?xiàng)l件下，根際土壤硒含量顯著高于根圍土壤硒含量（P=0.0231<0.05）而0.5、10.0、20.0、40.0 mg/L 硒處理組根際土壤硒含量與根圍土壤硒含量沒有顯著差異，這說明2.5 mg/L硒處理蘿卜植株生長旺盛、根系發(fā)達(dá)，從根圍吸收硒的能力較強(qiáng)。但當(dāng)外源硒濃度過高時(shí)，抑制了蘿卜對(duì)根圍土壤中硒含量的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.4 葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)蘿卜硒形態(tài)的影響

蘿卜葉中硒主要以SeMet、SeCys2、Se （Ⅳ）3種形式存在（圖5、表2、表3），其中SeMet含量達(dá)1.51 mg/kg，SeCys2含量0.47 mg/kg，Se （Ⅳ）含量0.08 mg/kg;蘿卜果實(shí)中硒主要以SeMet、SeCys2等2種形式存在，其中SeCys2含量 0.29 mg/kg，SeMet含量達(dá)0.10 mg/kg， 且沒有四價(jià)硒存在，說明蘿卜從葉中吸收無機(jī)硒在體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化變?yōu)橛袡C(jī)硒。

2.5 葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)蘿卜抗氧化能力的影響

6個(gè)處理組的蘿卜葉片中GSH-Px、POD、SOD的活性差異見圖6，可以看出與對(duì)照組相比，蘿卜葉中GSH-Px活性隨著施硒濃度升高有著顯著變化，0.5、2.5 mg/L硒處理先增大，10.0、20.0、40.0 mg/L硒處理又有明顯的下降趨勢(shì)?？梢娺m宜濃度的硒能夠促進(jìn)GSH-Px合成，從而提高酶的活性，但是過量的硒可能會(huì)破壞植物體內(nèi)的代謝平衡，本研究中，與對(duì)照組相比，2.5 mg/L硒處理組葉片中GSH-Px活性增加了106.26%（P<0.05），40.0 mg/L處理組葉中 GSH-Px 活性降低了5.86%。這可能是高濃度的硒影響了 GSH-Px 合成的誘導(dǎo)信號(hào)，從而破壞了植物體內(nèi)環(huán)境平衡，導(dǎo)致GSH-Px活性降低。

與對(duì)照組相比，POD活性在0.5、2.5 mg/L硒處理?xiàng)l件下顯著增加，分別增加了10.46%、14.87%（P<0.05）;在100、20.0、40.0 mg/L硒處理組有一定的降低趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，總SOD活性在0.5、2.5、10.0、20.0 mg/L硒處理下有一定的上升趨勢(shì)，無顯著性差異，但是在40.0 mg/L硒處理組卻顯著降低了40.49%（P<0.05）。本研究中POD、SOD活性沒有隨著外源施硒濃度的增加而出現(xiàn)顯著性變化趨勢(shì)，可能是由于POD的輔酶因子是鐵，SOD的輔酶因子是鐵、錳、銅、鋅，外源硒通過影響輔酶因子的吸收和在分布，從而調(diào)節(jié)抗氧化酶活性。因此對(duì)POD、SOD 2種酶活性的影響不是十分顯著。

3 討論與結(jié)論

硒不是植物必需微量元素，但一定濃度的硒能夠影響植物的生長發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量[29-30]。本試驗(yàn)中，葉面噴施2.5 mg/L的亞硒酸鈉對(duì)蘿卜果實(shí)有增產(chǎn)作用，隨著噴施濃度的升高，產(chǎn)量下降，果實(shí)顏色發(fā)紫，有明顯的病變現(xiàn)象?？梢娞}卜的產(chǎn)量受施硒濃度的影響，適量的施硒濃度能夠促進(jìn)蘿卜生長，提高產(chǎn)量，但是過量的硒則會(huì)抑制蘿卜生長，還可能出現(xiàn)病變。該結(jié)果與硒對(duì)小麥和油菜[31]、苜蓿[32]生物量影響的研究結(jié)果一致。

蘿卜葉和果實(shí)中硒吸收富集量隨著外源施硒濃度增加而增加，并未出現(xiàn)對(duì)硒吸收同化的抑制作用，但蘿卜對(duì)硒的轉(zhuǎn)移系數(shù)是逐漸降低的，這與硒在小麥[33]、紫甘薯[34]中富集規(guī)律一致，說明高等植物對(duì)硒的吸收富集機(jī)制是相當(dāng)復(fù)雜的，值得進(jìn)一步研究。蘿卜不同部位吸收硒的能力有差異，本研究發(fā)現(xiàn)硒主要累積在蘿卜葉中，果實(shí)中轉(zhuǎn)移量較少。這與在甜菜、大麥、番茄上的研究結(jié)果[35-36]一致，植物的可食用部位富硒能力低于非食用部位。研究發(fā)現(xiàn)，十字花科蕪菁甘藍(lán)硒吸收含量和土壤本底中硒含量沒有顯著的相關(guān)性[37]。本試驗(yàn)所用盆栽土壤本底硒含量為1.67 mg/kg，但對(duì)照組蘿卜葉和果實(shí)中硒含量較低，說明在自然土壤條件下蘿卜對(duì)硒的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力較低，可能是由于土壤中有效態(tài)硒含量較低等因素導(dǎo)致[23]。并且不同種屬的植物在同環(huán)境下硒富集能力也是有差異的[24]。通過葉面施硒能夠顯著提高蘿卜對(duì)硒的吸收富集能力，因此不同植物對(duì)硒的富集能力是由外源施硒方式、施硒濃度、生長環(huán)境有效硒含量和植物種類等多重因素共同決定的。

大多數(shù)植物性硒源中有機(jī)硒主要以硒代蛋氨酸形式存在的[38]。葉用萵苣以四價(jià)硒作為硒源，發(fā)現(xiàn)約有1/3轉(zhuǎn)化為硒代蛋氨酸[39]。本試驗(yàn)中蘿卜葉中有機(jī)硒主要以硒代蛋氨酸為主，含量為1.51 mg/kg，而蘿卜果實(shí)中有機(jī)硒為硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，其中硒代胱氨酸的含量達(dá) 0.29 mg/kg，未檢出四價(jià)硒，說明葉面噴施亞硒酸鈉經(jīng)蘿卜轉(zhuǎn)化吸收變?yōu)橛袡C(jī)硒存在于蘿卜果實(shí)中。

硒能夠通過影響抗氧化酶活性從而增強(qiáng)植物的抗氧化能力。硒作為植物生長有益的元素之一，參與合成谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），通過調(diào)節(jié)植物內(nèi)環(huán)境離子平衡，來提高過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性[40]。三葉草施加低濃度（1～5 μmol/L）硒能夠提高SOD、POD活性，高濃度（10～30 μmol/L）條件則會(huì)出現(xiàn)降低[41]。本研究中在一定硒濃度范圍內(nèi)，能夠不同程度提高3種抗氧化酶（GSH-Px、POD、SOD）的活性。隨著施硒濃度的增加，GSH-Px、POD、SOD活性呈現(xiàn)明顯的先增大后降低的趨勢(shì)，40 mg/L硒處理組時(shí)3種酶活明顯降低，可能是由于當(dāng)硒濃度過高會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致抗氧化酶活性出現(xiàn)明顯降低。因此，適宜濃度的外源施硒能夠提高GSH-Px、POD、SOD酶活性，從而增強(qiáng)植物的抗氧化能力。

外源葉面施硒能夠促進(jìn)生長在土壤有效硒含量較低的環(huán)境中的蘿卜吸收富集硒。綜合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉面噴施25 mg/L硒處理有利于促進(jìn)蘿卜生長，提高蘿卜硒含量，增強(qiáng)抗氧化能力。40.0 mg/L硒處理會(huì)抑制蘿卜生長，降低其抗氧化能力，出現(xiàn)病變癥狀，導(dǎo)致植物產(chǎn)量、品質(zhì)降低。植物雖然處在富硒環(huán)境土壤中但其對(duì)土壤中硒的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)受植物種類和生長環(huán)境等因素的影響，導(dǎo)致植物對(duì)硒的吸收轉(zhuǎn)化差異化，因此結(jié)合外源葉面施硒能夠較好地達(dá)到植物富硒要求。

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